特发性膜性肾病靶抗原及其自身抗体研究的新进展

田彩霞 裘宇容

·综述·

特发性膜性肾病靶抗原及其自身抗体研究的新进展

田彩霞 裘宇容

膜性肾病(membranous nephropathy，MN)是一种以上皮下免疫复合物沉积为主，伴有尿蛋白排出增加为特征的肾小球疾病，是成人肾病综合征的主要原因。该疾病影响各年龄段、各民族和种族，且在男性中更常见(男女发病比为2.1)，发病高峰年龄在40～60岁。在欧洲，成人MN每年发病率为十万分之一，每年大约一万新发病例[1]。在中国，MN占原发性肾小球疾病的比例逐渐升高，从2003年14.84%到2012的37.68%[2]。MN在没有任何诱发因素下发生的自身免疫性肾小球疾病为特发性膜性肾病(idiopathic Membranous nephropathy，IMN)大约占总MN的70%～80%，另外的20%～30%的MN继发于其他疾病如系统性红斑狼疮，乙型、丙型肝炎或梅毒感染，药物中毒或恶性肿瘤[3]。

既往的研究报道了中性肽链内切酶，阳离子化牛血清白蛋白，α-烯醇化酶，醛糖还原酶和超氧化物歧化酶等是某些MN的靶抗原[4]。近年来，通过特异性自身免疫性反应，人们认识了新的足细胞靶抗原和相应的自身抗体。在2009年和2014年，基于肾小球显微解剖技术、蛋白质组学技术和质谱分析技术，两种IMN的抗原靶点被确认——M型磷脂酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor，PLA2R)和1型血小板反应蛋白7A域(trombospondin type-1 domaincontaining 7A，THSD7A)[5-6]。本文将IMN相关的这两种抗原和自身抗体的研究进展综述如下。

一、PLA2R及其与IMN的病理机制

PLA2R属于1型跨膜糖蛋白，是甘露糖受体家族成员之一，含有一个细胞外糖基化区域，由N端富含半胱氨酸的区域(CysR)、II型纤连蛋白样区域(FnII)和8～10个C型凝集素样区域(CTLD)三部分组成，介导了一系列生物活性，如诱导细胞增殖、细胞迁移和脂质的生成。Fresquet等[7]描述了位于CysR、FnII、CTLD3、CTLD 1/2和CTLD 2/3之间的八个肽段，可作为潜在的PLA2R主要抗原表位的组成部分。这些肽并非连续贯穿在PLA2R的一级结构，而是通过二硫键相互靠近，形成抗原表位的三维形态特征。而Kao等[8]首次确认了PLA2R的免疫优势表位位于CysR-FnII-CTLD1区，缺乏CysR 或者 CTLD1区域会使剩下的片段失去抗原性，CTLD1在保持抗原表位的结构稳定性方面很重要。

IMN患者免疫反应的主要特征是Th2淋巴细胞广泛激活，然后产生某些细胞因子，尤其是IL-4，IL-10和 IL- 13。IL-4接下来激活B淋巴细胞合成IgG4，IgG4是IMN患者主要的免疫球蛋白亚型。IgG4与足细胞表面的PLA2R1的构型表位结合，形成典型的上皮下免疫复合物。

免疫复合物的形成和聚集通过补体依耐的途径打破了肾小球滤过屏障的功能完整性，IgG4抗PLA2R抗体含有缺乏半乳糖的侧链，N-乙酰氨基葡萄糖可以在终端位置暴露并激活甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)，因此推测补体激活的MBL途径是主要的。Lhotta等[9]确认了MBL途径在MN患者中的作用。MBL激活两个丝氨酸蛋白酶(MASP 1/2，MBL相关的丝氨酸蛋白酶)，其作用类似C1r和C1s，可裂解C4和C2。C4b和C2a结合在一起形成C3转化酶，如同经典的通路，最终导致膜攻击复合物的形成。然而，不是所有情况下IMN均由MBL途径激活补体。Debiec等[10]描述了一位肾移植13 d后IMN复发的患者，肾脏穿刺活检检测提示存在典型的C3, C5bC9, C1q和IgG3的染色颗粒，但是没有 MBL或IgG4染色颗粒，在这种特殊情况下，MN主要由补体经典途径激活。

膜攻击复合物插入到足细胞膜后，被足细胞吞噬并激活足细胞，继而发生一系列的不良反应，如生成大量活性氧，细胞外基质增多，足细胞骨架改变，足细胞凋亡，最终导致肾小球基底膜的功能改变，破坏肾小球滤过屏障的完整性，从而产生大量蛋白尿。

1.抗PLA2R自身抗体作为诊断IMN的特异性指标 2009年，Beck等[5]报道了表达于足细胞表面的PLA2R可作为IMN的靶抗原，随后大量的文献对循环中抗PLA2R自身抗体进行研究，确认PLA2R是成人IMN的主要目标抗原，对于IMN，抗PLA2R自身抗体具有很高的特异性，循环中，抗PLA2R抗体在约70%的IMN患者可检测出来，其他肾病或者自身免疫性疾病或者正常人群均未检测到抗PLA2R抗体，在继发性MN中阳性频率非常低[11]。

最近几年的研究表明抗PLA2R抗体是诊断IMN的特异的和敏感的生物标志物，抗 PLA2R自身抗体的检测对区分原发性MN和继发性MN有非常重要的作用。

肾穿刺组织样本免疫沉积物中的PLA2R抗原的检测也为诊断IMN提供了线索。当循环抗体阴性时，同样可以检测到免疫沉积物中的抗原。在某些患者，循环抗PLA2R抗体与PLA2R沉积没有相关性，沉积物中PLA2R抗原阳性经常见于活动性结节病或乙肝病毒感染相关性MN[12]。因此诊断IMN时，应结合血清学和活检分析。在最近的一个包含了1 160例患者的荟萃分析[13]数据显示：血清抗PLA2R抗体总的灵敏度、特异性、诊断优势比和受试者工作特征曲线下面积分别为68% (95% CI，0.61-0.74)，97% (95% CI，0.85-1.00)，73.75 (95% CI，12.56-432.96) 和 82% (95% CI，0.78-0.85)，肾小球PLA2R 染色的总的灵敏度、特异性、诊断优势比和受试者工作特征曲线下面积分别为78%(95% CI，0.72-0.83)，91% (95% CI，0.75-0.97)，34.70 (95% CI，9.93-121.30) 和84% (95% CI，0.81-0.87)，血清学抗PLA2R抗体检测具有诊断价值，血清抗PLA2R抗体阴性时，推荐行组织PLA2R染色。另一个来自15个研究的包含2 212位患者的荟萃分析[14]数据表明，抗PLA2R抗体的灵敏度为78% (95% CI，0.66-0.87)，特异性为99% (95% CI，0.96-1)。

循环中抗PLA2R抗体检测试剂盒的开发以及临床运用实践发展迅速，来自欧蒙的两款标准的检测试剂盒已运用于临床，非常适合常规诊断，一个是间接免疫荧光检测，另一个是酶联免疫吸附试验。间接免疫荧光检测基于转染人长段PLA2R cDNA并包被在HEK293细胞上的生物芯片技术[15]。

基于人PLA2R细胞外结构域的酶联免疫度吸附试验试剂盒能定量并快速检测抗PLA2R抗体，与免疫荧光法有很好的相关性[16]。在一项275例穿刺确诊IMN的队列研究中[15]，使用ELISA方法，抗PLA2R自身抗体特异性可达到100%，灵敏度可以达到77%。

2.抗PLA2R自身抗体可监测疾病的活动性 Beck等[5]人首次描述了抗PLA2R抗体和IMN活动性之间存在密切关系，随后一些研究也证实，抗PLA2R抗体和IMN活动性指标如尿蛋白、血清白蛋白水平之间存在相关性，抗体水平升高，表示尿蛋白浓度增加，尿蛋白减低往往在抗体浓度减低之后[17]。在一篇来自意大利肾病中心实验室的系统性回顾分析性文章中，通过纵向设计，分析了PLA2R的变化与PLA2R阳性IMN患者临床进展的相关性[18]，他们发现PLA2R抗体的降低与尿蛋白的含量成正相关，与血清白蛋白的含量成负相关。抗PLA2R自身抗体水平与IMN患者疾病活动性相关。

根据抗PLA2R抗体的滴度可以预测患者处于活动性或部分缓解还是完全缓解。疾病的活动期抗体水平高，自发缓解或治疗缓解后，则抗体水平降低，疾病复发则抗体浓度再次增加[19]。此外，抗PLA2R抗体水平与肾损伤指标，如尿β2-微球蛋白、尿IgG、血清肌酐呈正相关，进一步支持血清抗PLA2R抗体效价与疾病活动性的相关。

3.抗PLA2R自身抗体可预测疾病预后 通常，IMN可以自发缓解或者表现为持续性蛋白尿而无肾功能损伤，但是30%～40%的患者可以在数年内发展为终末期肾病。自身抗体浓度的检测也可以预测临床结果：在一个多中心的回顾性研究[20]中，包括了133例未接受免疫抑制剂治疗的IMN患者，经免疫抑制剂治疗3个月后，抗PLA2R自身抗体降低了81%，同时蛋白尿降低了39%。经12个月治疗后蛋白尿得到缓解的患者的抗PLA2R自身抗体最初水平与那些蛋白尿未缓解的患者相比，显著降低。因此，具有较高效价抗PLA2R 抗体的患者提示疾病处于活动期，不可能自发缓解，他们可能受益于早期及时使用免疫抑制剂方案。

抗体水平可预测预后，高滴度与复发的风险相关，与非肾病患者的发生肾病综合征高风险相关，并与肾功能恶化相关[21]。在另一份报告中，高抗PLA2R 抗体患者无论是自发或治疗后都不易缓解，抗体的效价成为无法缓解的独立危险因素[22]。抗PLA2R抗体还是敏感的提示治疗效果的标志物。抗PLA2R抗体部分或完全消失预测肾在数周或数月可恢复，抗体的重新出现或升高预测疾病复发[23]。

据报道，抗PLA2R自身抗体在评估肾脏移植后IMN复发的风险有一定作用[24]。大于40%的IMN患者经肾移植后，可复发。如果抗PLA2R自身抗体在器官移植后6个月内持续表达，那么肾移植后IMN复发的风险非常高[25]。因此，自身抗体水平的检测，在评估移植后免疫抑制剂治疗的必要性和强制性方面是有用的。除了鉴别诊断IMN，抗PLA2R自身抗体还可以评估疾病的活动度和预测疾病转归的灵敏度，同时可预测肾移植后IMN复发的风险。另外，也有益于治疗策略的选择和治疗效果的监测。

4.抗PLA2R自身抗体可指导治疗 抗PLA2R 自身抗体检测标志着IMN患者的个性化医疗管理的开始，抗体滴度高的患者，从开始使用免疫抑制剂治疗到缓解的时间间隔显著延长[26]。抗体滴度下降后，蛋白尿仍然持续数月，延迟的临床反应可能是由于恢复肾小球基底膜功能完整性，如清除免疫复合物，足细胞的恢复需要时间。

通过测定抗PLA2R抗体效价，可获得与疾病的免疫活性相关的信息，并可用于监测IMN的治疗效果。在这方面，Beck等[27]对35例使用利妥昔单抗治疗后的患者做了远期疗效评价，经过12个月的治疗，抗体转阴的患者59%病情完全或部分缓解，而抗体持续阳性的患者无一人缓解，经24个月治疗后，抗体转阴的患者88%病情完全或部分缓解，而抗体持续阳性的患者33% 完全或部分缓解。同样，Bech等[28]观察到在完成免疫抑制剂治疗的患者，抗体水平可预测长期治疗的效果：在治疗结束时，抗体阴性的患58%在之后5年，病情处于持续缓解状态。因此，抗PLA2R抗体检测在评估IMN患者对治疗的反应性和预测远期效果方面是有意义的。抗PLA2R抗体滴度可能成为疾病结果和药物反应的预测指标，通过抗PLA2R抗体的检测，选择一种有效的治疗手段，可限制患者暴露于毒性药物，而不影响治疗效果，且降低治疗费用。

有学者提出应该修改“改善全球肾脏病预后组织的指南”，在诊断IMN时应包括抗PLA2R抗体检测。推荐在开始使用免疫抑制剂治疗之前，抗体每两个月检测一次，对进入免疫缓解的患者可避免不必要的治疗。在使用免疫抑制剂治疗的头6个月每月检测一次抗PLA2R抗体。

抗PLA2R抗体检测应用到临床实践很有必要，但是抗PLA2R 抗体滴度的临界值仍有待确定。总之，抗PLA2R抗体的测定是一个有用的工具，抗PLA2R抗体阳性，且通过临床体检和实验室检查能够确定IMN的患者，原则上可以避免肾穿刺活检，为患者减少痛苦和经济负担，国家应该尽快增补抗PLA2R抗体的物价收费标准，让更多的医院能够合法地开展抗PLA2R抗体的检查，让IMN患者受益。

本课题组用两种方法检测血清抗PLA2R抗体，在中国人群中验证了抗PLA2R抗体可以作为原发性膜性肾病的敏感的特异性指标，并且抗PLA2R抗体浓度与肾性蛋白尿浓度密切相关，可以作为监测膜性肾病活动性的理想指标[29]。

二、抗THSD7A 自身抗体

2014年，Tomas等[6]发现15例(大约2.5%～5%)IMN患者的血清中存在针对1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)的循环抗体，并且证实THSD7A是参与成人IMN发病的第二个靶抗原，针对这个抗原的循环自身抗体在5%～10%的抗PLA2R阴性的IMN患者中被检测到。

THSD7A与PLA2R结构和生化特性类似，含有一个由许多重复的二硫键所组成的大型胞内区域和N-糖基化区域，表达于足细胞膜上，并且只有在非还原状态下才与血清抗体发生反应。为了确定抗THSD7A抗体的IgG亚型，研究者使用了针对IgG1-IgG4的第二抗体。发现虽然其它IgG亚型在大多数血清样本中有微弱表达，但IgG4才是抗THSD7A抗体的主要亚型。在血清抗THSD7A抗体阳性的IMN患者的肾活检样本中也发现THSD7A与IgG4共定位。

有趣的是，血清THSD7A抗体全部表达于抗PLA2R抗体阴性的患者，这些患者代表着一种独特的疾病亚型。患者对PLA2R或者THSD7A产生自身免疫，而不是同时产生，这表明PLA2R和THSD7A相关的IMN是两种独立的分子实体，这些抗原在该疾病是主要抗原。研究者比较了其各自阳性患者的临床特点。发现两组患者在年龄，尿蛋白水平，血清白蛋白，血肌酐和诊断后6个月内对免疫抑制治疗的反应之间无显著性差异。但是抗THSD7A抗体阳性组的女性患者更多(65% vs 27%)，因为样本量小，这一结论尚存在偏倚。

Iwakura等[30]报道了THSD7A在日本IMN患者中肾穿刺样本中的表达水平，9.1%(5例)IMN患者THSD7A阳性，且均来自PLA2R阴性的IMN患者。随后，Hoxha[31]在198例IMN患者发现4例THSD7A抗体阳性，157例PLA2R抗体阳性，无患者两种抗体均阳性。抗THSD7A抗体可作为抗PLA2R抗体阴性的IMN患者的诊断指标，特异性100%，与抗PLA2R自身抗体类似，抗THSD7A自身抗体水平与疾病活动性的关系被证实。且抗THSD7A和PLA2R抗体均阴性的患者有较好的预后。

然而，2016年，Larsen等[32]报道了THSD7A和PLA2R并非相互排斥的，发现2例IMN患者肾脏穿刺组织同时检测到THSD7A和PLA2R抗原，血清中也同时出现抗THSD7A和PLA2R自身抗体，推测其中一个自身抗体可能是足细胞抗原暴露于疾病后形成的机会致病性抗体，或者两种抗原均有致病性，某些患者从基因水平上易于产生两种抗体。

三、展望

目前自身抗体作为IMN的诊断的发展包括抗PLA2R 和THSD7A。基于THSD7A的间接免疫荧光检测试剂盒目前正在研究，不久的将来也可运用于临床，然而在中国人群广泛开展抗PLA2R 和THSD7A自身抗体的检测还有很长的一段路要走，一方面，政府要尽快制定物价标准，另一方面，研究者要提供中国人群抗PLA2R 和THSD7A自身抗体联合诊断IMN的灵敏度和特异性。此外，目前仍有部分 IMN 患者的靶抗原未明确， 寻找靶抗原及相应抗体的研究仍有必要继续进行。

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2016-07-19

2016-11-25)

湖北省卫生计生委面上项目(No.WJ2017M217)

10.3969/j.issn.1671-2390.2017.09.014

442000 十堰，湖北医药学院附属人民医院检验科(田彩霞)；510515 广州，南方医科大学附属南方医院检验科(田彩霞，裘宇容)

裘宇容，E-mail: qiuyuronggz@126.com