免疫组化技术在氯胺酮诱导致精神分裂症中的应用进展

解润芳 李玉雯 解继明

综述

免疫组化技术在氯胺酮诱导致精神分裂症中的应用进展

解润芳 李玉雯 解继明

本文阐述了精神分裂症的发病机制，提出了用新型毒品氯胺酮建立精神分裂症SD大鼠动物模型，并提出用免疫组化技术对大鼠海马及前额叶皮质区的精神分裂症阳性细胞进行定位的方法，同时也讲述了免疫组化技术的应用，这将为精神分裂症的鉴定及个性化治疗提供依据。

精神分裂症；氯胺酮；动物模型；免疫组化

作者单位：650500 昆明，昆明医科大学法医学院（解润芳）；650011昆明，云南省第三人民医院（李玉雯，解继明）（通讯作者：解继明，E-mail: 1196531552@qq.com）

1 精神分裂症

精神分裂症病例临床发病机制过于复杂，由于未能深入了解其细胞生物学特征以及发病机制等信息，因此在病因学的专项研究方面还处于滞后状态。有研究发现，NMDA型受体拮抗剂所致精神分裂症临床症状较之于DA受体激动剂而言更为广泛，以苯环利定为例，该药物除了可能使机体出现阳性症状外，还可能会有认知功能降低问题、阴性症状等同时出现。而通过分析精神分裂症病例，发现当动物或者人应用联苯西平、苯环利定或者氯胺酮等谷氨酸NMDA型的受体拮抗剂后，其行为会出现异常，而且伴随着精神分裂症相关疾病症状出现。氯胺酮在临床上属于苯环己哌啶物质的一种衍生物，同时还是NMDA型受体拮抗剂中的一种非竞争性药物，不仅会使动物或者人出现妄想症状或者幻听症状等阳性症状，而且还可能有认知缺陷问题、情感淡漠问题等阴性症状等出现。针对此情况，针对该疾病，通过制作专业动物模型，并以猴以及啮齿动物为对象，观察其特征，发现其应用NMDA型受体拮抗剂后，会有拒绝社会交往行为、多动问题、认知运动异常问题、动作呆板行为等发生，以至于精神分裂症相关疾病症状出现。本文提出用新型毒品氯胺酮建立精神分裂症的SD大鼠模型，此模型能更好地模拟精神分裂症的阴性及阳性症状。

1.1 精神分裂症病理、生理的基本部位以及生化指数研究 有神经精神遗传的研究者Weinberger调查研究发现，精神分裂症即大脑内最高层级的信息整理过程发生异常，主要表现在患者本身的神经系统皮层微循环的生长及平稳性出现异常或是受损。大量临床资料结果显示，前额叶皮层（prefrontal cortex,PFC）于NMDA受体拮抗剂引发的人类与动物罹患的精神分裂症样病症中起关键作用。NMDA受体大多出现在PFC的外部区域内，而PFC即NMDA受体拮抗剂引发的精神分裂症这一疾病的病理及生理基本部位，急性予以NMDA受体拮抗剂可以提升大鼠PFC内Glu的扩散，让细胞之外的谷氨酸浓度提升，进而发挥兴奋型神经毒性功能。当前，精神分裂症患者还没有普遍认证的特异型生化指数。有研究指出精神分裂症患者本身的血清肌酸激酶（creatine kinase,CK）浓度对比普通人而言更多[8-11]。之后，又有研究提出急性功能型精神病初始阶段的血清肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase,CPK）浓度也会上升。Meltzer氏提出了精神分裂症患者本身的CPK活性上升，其一是于精神病出现的第1周；其二是需要长期住院进行治疗及需要大剂量的神经镇定性药品进行治疗；最后是伴随精神行为量表值上升，且引发很多幻觉与兴奋状况。近几年各个国家的资料均表明，精神分裂症患者本身会出现一氧化氮（nitric oxide,NO）的水平异常。

1.2 MAPK信号转导通路及其与精神分裂症的相关性 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）主要存在于哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，其是当前临床已知的一种信号转导通路分子，此种信号通路包括6个亚类：SAPK/JNK通路、ERK1/ERK2通路、ERK5通路、P38MAPK通路、ERK7通路以及MOK通路；其中，细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）通路是当前临床研究中最活跃的一种信号转导通路；其能够有效调节细胞分化、增殖等生物反应，除此之外，此种通路还能够对行为反应以及记忆、学习等认知方面起到关键性的作用。MAPK通路能够由多种激化因子活化，而一旦ERK通路激活以后，此通路中各组分，特别是激活以前、激活以后通路组分亚细胞的定位改变，信号激活持续的强度和时间，支架蛋白和通路担保之间相互的作用以及和其他通路交叉影响等均能够参与到即刻早期基因（immediate early genes,IEG）编码蛋白稳定性的调节中，进而诱导出更为宽泛的下游蛋白表达，并在细胞生理应答调节中起到中药的作用。

大量临床研究发现，精神分裂患者的小脑蚓部MAPK表达的水平呈增高的趋势，有学者通过基因工程法研究I型神经纤维母细胞瘤（nerve fibroblastoma type-I,NF1）和神经发育迟缓相关性时发现，海马Ras/ERK信号通路缺损和学习功能下降呈正相关。近几年来，随着临床研究的深入，脑内长时程增强形成、MAPK/ERK信号通路和学习极易的功能之间存在重要的关联。且愈来愈多的研究对信号分子ERK功能有了更进一步的认识，为ERK信号通路能够参与到记忆形成的神经元可塑性中是研究最重要的一个发现。另有学者研究还发现，在注射PCP的精神分裂大鼠中，PCP呈现出剂量依赖性上调ERK2、ERK1磷酸化水平；此种研究结果仅仅出现在大鼠小脑部位，而大鼠脑干、额前叶皮质、海马部位均未出现上调的情况；由此表明，精神分裂发展与发展和MAPK信号通路呈正相关。

2 免疫组化

免疫组化是应用了抗体与抗原特异性的结合原理，此原理作为免疫学最基本的原理，其主要是经化学反应对标记抗体进行显色，以此来确定组织内的细胞抗原，并对其行定性、定位、相对定量研究；临床中将其称之为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）[1]。

2.1 免疫组化分类 免疫组化的化学技术和分类可依据标记物种类进行划分，共分5种：一是免疫荧光技术；二是免疫酶细胞化学法；三是免疫金法；四是免疫天蛋白技术；五是放射免疫自显影法。这些常用免疫组织化学方法的原理如下：①免疫荧光细胞化学法：此种方法主要是在已知的抗体上，标记荧光素，以此当作探针来检验组织或细胞内相应抗原，并在荧光显微镜下进行观察；一旦抗原抗体复合物当中的荧光素受到激发光照射就会自动发出波长荧光，进而对组织中抗原定量与定位进行研究和确定。②免疫酶细胞化学法：此种方法是当前免疫组织化学检验及研究时最常用的一种；其运用的原理主要是通过酶标记抗体和组织或者细胞作用，将酶底物加入进去，使之产生有色、不溶性地产物，再采用电镜或光镜对组织或细胞内相应抗原行定性或定位的研究。③免疫胶体金技术：是用胶体金标记一抗、二抗或其他的能特异性的结合免疫球蛋白的分子等作为探针对组织或细胞内的抗原进行定性、定位或定量研究。

2.2 标本、抗体及常用染色方法[2]①标本：临床实验检验中所选用的标本主要包括两大类，一类是组织标本：此标本主要进行的是冰冻与石蜡切片，而石蜡切片主要进行病理切片以及组织芯片；另一大类则是细胞标本：此种标本中囊括了细胞爬片、组织印片以及细胞涂片。在所有的标本中，最为常用且最基础的制作标本的方法是石蜡标本，其能够很好地保存组织形态，而且还能够进行连续切片，更好地观察各种染色对照；除此之外，石蜡标本还能够进行长期的存档，以供后期回顾性的研究。而在对石蜡切片进行制作时，组织内的抗原暴露会受到一定影响；但可以对其进行修复，因此，石蜡切片是免疫组化组织标本制作的首选方法。②抗体：在免疫组化检验中，常用抗体主要有两种，一种是单克隆的抗体：此种抗体属于B淋巴细胞克隆分泌抗体，多用于细胞融合杂交瘤免疫动物的制备过程中；一种是多克隆的抗体：此种抗体主要针对的是纯化以后抗原的直接免疫动物，从此种动物的血液中获取免疫血清；多克隆抗体主要是由多种B淋巴细胞克隆后产生的一种抗体混合物[3]。③常用染色方法：此种方法主要是根据不同标记物进行分型，可分为亲和组织化学法、免疫酶标法以及免疫荧光法；其中，亲和组织化学法主要是建立在一种物质对于某种组织成分有较高的亲合力上来进行检测；且此种检测方法的敏感度较高，能够更有效地定位亚细胞或细胞中微量抗体（抗原）；而另外一种生物素-抗生素染色方法是临床最为常用的[4,5]。

2.3 操作步骤 ①将石蜡进行切片后脱蜡为水。②3%H2O2室温孵育5 min-10 min，其目的在于将内源性过氧化物酶活性进行消除；③用蒸馏水进行冲洗，PBS浸泡5 min×2（对于需进行抗原修复者，可在此步骤结束后实施修复）。④用5%-10%的正常山羊血清进行封闭以后，放置在室温下进行10 min的孵育，将血清倾倒，但不要进行清洗。滴加一抗工作液，37oC孵育1 h-2 h或4oC过夜。⑤PBS冲洗，5 min×3次。⑥滴加适量生物素标记二抗工作液，37oC孵育10 min-30 min。⑦PBS冲洗，5 min×3次。⑧滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37oC孵育10 min-30 min。⑨PBS冲洗，5 min×3次。⑩显色剂显色3 min-15 min（DAB或NBT/BCIP）。自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

2.4 临床应用 近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现，使许多疑难疾病得到了明确诊断。在常规疑难疾病理诊断中，5%-10%的病例单靠HE染色难以作出明确的形态学诊断。免疫组化在疑难疾病诊断和鉴别中的实用价值受到了普遍的认可，其在低分化或未分化疑难疾病的鉴别诊断时，准确率可达50%-75%。

临床应用免疫组织化学的方面有以下几个：①对恶性肿瘤进行鉴别与诊断；对转移性恶性肿瘤原发的部位进行确定；③进一步对某种肿瘤进行病理分型；④治疗软组织肿瘤时，通常需要精准的组织学分型，但由于组织学的种类较多、组织的形状较为相似，使得组织来源区分难度较高；而将多种类型的标志行免疫组化研究，能够有效确诊软组织肿瘤；⑤使用免疫组织化学检测能够及时发现微小的转移灶，进而确诊临床治疗方案以及手术的范围；⑥为临床提供治疗方案的选择[6-8]。

3 研究现状及展望

病理科作为临床最为重要的一个部门，其检查质量的高低对于疾病的治疗和预后尤为关键[9-11]；免疫组化技术是病理科的一种重要检查技术，其不仅能够对疑难病例诊治提供有利的依据，而且还能够对肿瘤治疗与药物选择提供指导的依据。当前我国大型医院中，均已经开始运用自动化免疫组化染色仪器进行检查；但部分中小型的医院依然使用人工进行操作。

人体抗原与抗体结合之间有较好的特异性，而免疫组织化学正是运用了此原理将细胞与组织化学物质进行提取以后作为抗原，以进行动物抗体的刺激，进而检测刺激以后的组织与细胞产生抗体以及组织和细胞同类的抗原[12-14]。免疫组化技术环节与过程相对较多，且内容复杂，关键步骤符合标准后获得的检验结果才能够有效可靠，因此看似简单的技术，其实不是非常容易掌握的。现在的科学技术发展快速，临床中对于医护人员的能力要求也是越来越高，对各项标准和规范认真的执行，才可以促进免疫组化的发展，让患者的临床治疗获得可靠的帮助。

1 丁爽,卢艳梨,孟凡翠,等.精神分裂症模型大鼠青春期脑内胶质细胞及白质的变化.中华行为医学与脑科学杂志,2015,24(10): 873-876.

2 陶成云.病理诊断中免疫组化技术的应用研究.大家健康(下旬版),2016,10(8): 152-153.

3 舒佩红.免疫组化技术在病理诊断中的应用.饮食保健,2015,2(15): 215-216.

4 关秀梅,孟亚飞,隋丽杰,等.免疫组化技术用于肺小细胞癌腺癌和鳞癌患者诊断中的效果观察.临床医药文献电子杂志,2016,3(32): 6365-6366.

5 于兵兵,刘艳峰,胡延涛,等.免疫组化技术、原位杂交技术检测尖锐湿疣结果对比分析.心理医生,2015,21(22): 135-136.

6 鲁秀仙.免疫组化技术在病理诊断中的应用探讨.大家健康(下旬版),2016,10(4): 65.

7 姬国强.免疫组化技术和常规技术在肿瘤病理诊断中的效果对比.中国当代医药,2015,22(23): 46-48.

8 彭凤英.病理组织免疫组化技术的研究.吉林医学,2014,35(12): 2615.

9 李春飞.浅谈免疫组化技术在病理诊断中的应用价值.医学信息,2014(39): 514.

10 吕莉.子宫内膜腺癌诊断中免疫组化技术的应用分析.中国医药指南,2015,13(17): 179.

11 高鹏.病理诊断中免疫组化技术的应用研究.中国现代药物应用,2014,8(20): 231-232.

12 郭海燕,郭黎黎,王志生,等.组织病理诊断中应用免疫组化技术的价值分析.中国继续医学教育,2015,7(5): 177.

13 李文龙.试论免疫组化技术在病理诊断工作中的应用进展.心理医生,2015,21(10): 75-76.

14 喻永洋.免疫组化技术、原位杂交技术用于结核病诊断中的价值评价.中国现代药物应用,2017,11(3): 55-56.

Application of immunohistochemistry in ketamine induced schizophrenia

Runfang XIE1,Yuwen LI2,Jiming XIE2

1School of Forensic Medicine,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2Yunnan Third People's Hospital,Kunming 650011,China

This paper described the pathogenesis of schizophrenia,proposed the use of new drug ketamine to establish schizophrenia SD rat animal model,and proposed by immunohistochemistry on the hippocampus and prefrontal cortex of schizophrenia positive cells,and the application of immunohistochemistry,which will provide the basis for the identification and personalized treatment of schizophrenia.

Schizophrenia; Ketamine; Animal model; Immunohistochemistry

云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金项目（No.2014FB013和No.2016FZ007）