普洱茶中微生物研究进展

季爱兵　龚婉莹　彭文书　刘聪　曾胤　严亮

摘要 普洱茶的发酵离不开微生物。对目前普洱茶加工与微生物的关系，普洱茶发酵微生物的研究方法和已发现微生物的种类以及优势菌种对普洱茶品质的影响进行了综述，指出应用高通量测序技术研究普洱茶从原料鲜叶到普洱茶成品整个过程中微生物种群变化的必要性，以便更加深入地了解普洱茶中微生物种群的消亡规律及其对普洱茶品质的影响。

关键词 普洱茶；发酵；微生物

中图分类号 S571.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）21-0253-03

普洱茶是以云南大叶种晒青毛茶为原料经后發酵加工而成紧压茶或散茶，普洱茶又按照其加工工艺将其分为普洱生茶和普洱熟茶。普洱熟茶是晒青毛茶经潮水、渥堆，经渥堆过程中物质变化是由微生物、酶、湿热、氧化等综合作用的结果，因其经过人工后发酵以区别于普洱生茶。

近年来，随着对普洱茶的深入研究，证实了普洱茶具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂和降血糖等功效[1-4]。晒青毛茶不经过微生物的发酵难以形成普洱熟茶所特有的香气和汤色，一般认为微生物或微生物酶的湿热作用对普洱茶品质的形成起着决定性作用[5-7]。

1 普洱茶加工方式与微生物

普洱茶鲜叶采摘经萎凋后，进行杀青，再揉捻，后晒干制得晒青毛茶。再由晒青毛茶加工得到普洱茶，其具体制作工艺流程如图1所示。

将晒青毛茶经人工增湿渥堆快速发酵而制成普洱熟茶[8]。普洱熟茶的加工方式借鉴于安化黑茶，但又不同于安化黑茶。其主要的不同在于普洱茶经过晒青毛茶这一步，而安化黑茶从揉捻到后发酵不经过干燥过程，再焙火干燥[9]。

普洱茶与红茶的发酵方式相比，普洱茶的发酵与红茶有些相似，都有茶多酚经氧化生成茶红素和茶褐素的过程，不同之处在于红茶发酵仅需要3～4 h，而普洱茶发酵所需时间较长，渥堆时间至少需要3～4周。因为红茶发酵时间短，所以微生物作用较少，主要是生物酶的作用，而普洱茶的发酵与微生物的作用是分不开的。

普洱原料晒青毛茶就有大量的内生菌，晒青毛茶又长期暴露在空气中，在研究中发现很多发酵过程中的微生物都在普洱茶鲜叶中[10]和茶园空气中[11-12]都有发现。普洱茶渥堆时，刚开始温度由室温缓慢升高，其潮水量常达到40%左右，堆温一般保持在28～55 ℃，非常适合微生物的生长。在发酵过程中，肉眼可见真菌菌丝。一般认为，普洱茶的加工过程离不开微生物的作用，普洱茶的品质与微生物的消亡有密切关系。

2 参与普洱茶发酵过程的微生物研究方法

2.1 微生物的传统分离鉴定

研究微生物学的传统方法是将茶叶与无菌水按一定比例进行均质，然再做梯度培养，以此来初步了解渥堆发酵中普洱茶中微生物数量，然后对分离得到的微生物进行纯培养，以更好地进行菌种鉴定或保藏。鉴定方法主要为形态学鉴定或根据生理生化性状，一般将结果与标准分类系统中微生物形态或生理生化性状进行对比[13]。该方法是研究微生物的主要方法，已成功证实普洱茶中确实存在细菌、酵母、霉菌和放线菌[14-28]。

2.2 微生物自动鉴定系统

鉴于微生物传统鉴定方法的缺陷如工作量大，不利于操作，还受限于鉴定者的专业知识和认知能力。传统鉴定方法还常常受培养条件的限制，很多微生物不能在培养基上被分离培养出来，造成了鉴定种群不够完整，使得人们无法全面了解普洱茶发酵过程中的微生物种群情况，多数只是鉴定到了优势菌种或是在一定的培养条件下表现为优势的菌群。

近年来微生物快速鉴定仪更多地应用到微生物鉴定工作来，该系统是将微生物与底物反应的生化类型与已知建立的数据库中的类型比较，使微生物鉴定更加快速、准确。Mo等[20]利用API ID 32C和API ID 50 CHL微生物快速鉴定系统对普洱茶发酵过程中的微生物进行鉴定，发现了多种酵母和细菌。但由于该系统是根据现有数据库中所提供的背景资料进行微生物鉴定，数据库资料会影响微生物鉴定的种类及准确性。

2.3 分子生物学方法

PACE N R的研究表明，传统分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%～10.0%[29]，传统鉴定方法还常常受培养条件的限制，很多微生物不能在培养基上被分离培养出来，造成了鉴定种群不够完整，使得人们无法全面了解普洱茶发酵过程中的种群情况，多数只是鉴定到了优势菌种或是在特定的培养中为优势的菌群。日本学者M.Abe等[30]应用PCR变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究普洱茶发酵过程中微生物群落结构，对不同发酵阶段的普洱茶中微生物种群进行了研究，发现普洱茶2种优势种群，同时在用孟加拉红培养基，PDA 培养基在 30 ℃ 培养时也证实了这一结论，进一步说明了将分子生物学方法用于普洱茶发酵过程中微生物学研究是可行的[30]。

剂量组也对普洱茶鲜叶中的内生菌[10]进行了研究，普洱茶渥堆发酵微生物的研究以及普洱茶区空气微生物[11-12]的研究中都分别采用了PCR，Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应）分子生物学的方法，扩增细菌的16SrDNA和真菌的ITS序列测定分析或 PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）对参与或有可能参与普洱渥堆发酵的微生物进行了鉴定。

吕昌勇[31]利用宏基因组学高通量测序研究方法认为，细菌是普洱茶渥堆发酵过程中的主要菌群，占总微生物的76.26%；真核生物次之，占16.35%。目前应用高通量测序在普洱茶渥堆发酵微生物的研究中很少涉及，赵 明等[32]在利用高通量测序方法研究普洱茶发酵过程中的微生物，对参与普洱茶渥堆发酵微生物种群作了初步的鉴定。Wei Zhang等[33]通过实时定量PCR研究认为，烟曲霉、微小根毛霉、热带假丝酵母菌、镰刀菌、Thermomyces lanuginosus、Aspergillus niger、blastobotrys adeninivorans、Rasamsonia emersonii、Asper-gillus tubingensis、Rasamsonia cylindrospora、Rasamsonia byss-ochlamydoides等嗜热菌在普洱茶渥堆发酵过程中起着重要的作用。

3 普洱茶发酵微生物研究进展

3.1 普洱茶微生物种群

陈宗道等[14]从20世纪80年代开始研究普洱茶中的微生物以来，已经证实细菌、酵母、霉菌和放线菌都参与了普洱茶的发酵。

周红杰和赵龙飞等[6，18]先后从普洱茶和普洱茶翻堆样品都分离得到了黑曲霉、酵母菌、米曲霉、根霉、灰绿曲霉和极少的细菌。方 祥等[23]，M.Abe等[30]以及杨瑞娟等[34-35]从不同年代的普洱茶和渥堆发酵的普洱茶中分离得到了霉菌（黑曲霉、微小根毛霉、牛根毛霉）、酵母、细菌（芽孢桿菌，Bacillus coagulans，球菌，无芽孢短杆菌，乳酸菌，植物乳杆菌，类乳酸片球菌和大量嗜热细菌）、放线菌。吕昌勇[31]认为，普洱茶发酵初期的优势细菌是变形菌门（Proteobac-teria），随后厚壁菌门（Firmicutes）上升成为优势菌，放线菌门（Acti-nobacteria）与Firmicutes在发酵后期繁成为共同优势菌。原料的优势真菌归类为no-rank-Fungi（65.39%），发酵过程中，曲霉属（Aspe-rgillus.sp）真菌一直处于优势；发酵中期环境中的根毛霉属（Rhizomucor.sp）先升高后降低。

3.2 优势菌种与普洱茶品质的关系

近年来，关于普洱茶与微生物关系研究更多地集中在优势菌种对普洱茶品质影响的研究，多数是将分离纯化后的微生物再接种到普洱茶中，用来研究普洱茶品质改变情况。陈秀燕等[36]将灰绿曲霉和青霉接种到普洱生饼茶和散茶中，能明显加速普洱茶陈化的作用，且能提高茶汤的香气。研究表明，灰绿曲霉和青霉接能加速茶叶中纤维和果胶的降解，使普洱茶更加甘滑、醇厚。董文明等[27]认为，普洱茶发酵过程中，黑曲霉产淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶，酵母菌产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶，细菌只产淀粉酶、蛋白酶。经过这些酶的作用后普洱生茶形成了普洱熟茶甘厚浓醇的品质特征。周才碧等[28]利用优势菌株黑曲霉纯种对普洱茶进行发酵试验，得到的茶样香气浓纯、汤色呈黑褐色、滋味较平和，且茶色素发生明显变化，表明黑曲霉可以作为发酵用菌种，适于普洱茶的渥堆发酵。康燕山等[37]对普洱茶在普洱茶发酵过程中添加外源酶和接种酵母，其结果表明，使用外源酶可增加普洱茶所含水溶性总糖及游离氨基酸的含量，接种酵母可明显加速普洱茶茶多酚的转化。

4 普洱茶发酵过程中微生物学研究存在的不足及展望

4.1 存在的不足

目前对参与普洱茶发酵微生物的研究都集中在优势菌和能培养的微生物上，对于非培养微生物研究仍然很少涉及，对于这些微生物在普洱茶渥堆发酵中的作用研究就更无从谈起。对于普洱茶发酵微生物对普洱茶品质的转化作用及其机制研究首先就要解决非培养的微生物鉴定工作。目前关于普洱茶中微生物发酵的研究已经日趋成熟，宏基因组学[38]也更多地应用于普洱茶发酵微生物研究中来，多数都是停留在第一代测序研究上。关于微生物对普洱茶品质的影响，更多的是在于研究接种某一种或多种优势微生物或酶对发酵品质的影响，而忽略了普洱茶发酵微生物群落对普洱茶发酵的影响。

4.2 展望

微生物第二代测序技术在环境微生物的研究方面已经非常成熟，已经广泛应用于环境微生物的研究[39-40]，而对普洱茶发酵中的微生物的研究结果却少之又少。吕昌勇[31]和赵 明等[32]利用高通量测序方法对普洱茶渥堆发酵中的微生物进行了研究，这一技术的应用为普洱茶中非培养微生物的研究提供了新的可能。高通量测序技术在环境微生物的研究中常比PCR-DGGE法检测灵敏度高 3.8～39.4倍[41]。

利用高通量测序技术将普洱茶从鲜叶到普洱熟茶成品的微生物组成作出系统研究，并总结出这些微生物生长和消亡规律，对普洱茶鲜叶、干茶、渥堆的每个时期和成品的微生物生态系统作出系统的研究，探明这些微生物在每个时期的组成情况如何，以使人们能更好地探明普洱茶在发酵中是否有有害微生物的参与，为明确这些微生物在发酵过程的作用提供更为全面而系统的研究对象，从而有利于更好地了解普洱茶发酵中微生物的消亡规律和其对普洱茶品质的影响。

5 参考文献

[1] 谭自立.茶和普洱茶的保健作用[J].云南茶叶，1994（3）：4-6.

[2] 周红杰，秘鸣，韩俊，等.普洱茶的功效及品质形成机理研究进展[J].茶叶，2003，29（2）：75-77.

[3] 赵龙飞，周红杰，安文杰.云南普洱茶保健功效的研究[J].食品研究与开发，2005，26（2）：114-118.

[4] 张冬英，施兆鹏，刘亚林.普洱茶药理作用研究进展[J].福建茶叶，2005（1）：43-44.

[5] 罗龙新，吴小崇，邓余良，等.云南普洱茶渥堆过程中生化成分的变化及其与品质形成的关系[J].茶叶科学，1998，18（1）：53-60.

[6] 周红杰，李家华，赵龙飞，等.渥堆过程中主要微生物对云南普洱茶品质形成的研究[J].茶叶科学，2004，24（3）：212-218.

[7] 龚加顺，周红杰，张新富，等.云南晒青绿毛茶的微生物固态发酵及成分变化研究[J].茶叶科学，2005，25（4）：300-306.

[8] 梁名志.普洱茶渥堆工序的研究现状[C]//海峡两岸茶叶科技学术研讨会论文集，2000：3.

[9] 金朱葆.认识和了解安化黑茶[J].中国茶叶加工，2009（3）：42-44.

[10] 季爱兵.普洱茶叶片中内生菌的鉴定[D].长春：吉林大学，2013.

[11] 路伟尧.普洱茶发酵微生物的溯源分析[D].北京：北京化工大学，2013.

[12] 路伟尧，吕杰，严亮，等.普洱茶区空气微生物的群落结构及生态分布[J].北京化工大学学报（自然科学版），2013，40（4）：103-108.

[13] CLETUSPK，JACKWF.The yeasts a taxonomic study[M].4th edition.New York：Elsevier，1998：15-18.

[14] 陈宗道，刘勤晋，周才琼.微生物与普洱茶发酵[J].茶叶科技，1985（4）：4-7.

[15] 赵龙飞，周红杰.酵母菌在普洱茶品质形成中的作用初探[J].茶苑，2003（2）：4-6.

[16] 许波，洪涛，唐湘华，等.普洱茶发酵过程中微生物及其应用研究进展[J].安徽农业科学，2010（1）：334-336.

[17] XU X Q，YAN M，ZHU Y.Influence of fungal fermentation on the devel-opment of volatile compounds in the Puer tea manufacturing process[J].Engineering in Life Sciences，2005，5（4）：382-386.

[18] 赵龙飞，周红杰.云南普洱茶渥堆过程中的主要微生物初探[J].商丘师范学院学报，2005，21（2）：129-133.

[19] JENG K C，CHEN C S，FANG Y P，et al.Effect of microbial fermentation on content of statin，GABA，and polyphenols in Pu-Erh tea[J].Agric Food hem，2007，55（21）：8787-8792.

[20] MO H Z，XU X Q，YAN M C，et al.Microbiological analysis and antiba-cterial activity of the in digenous fermented Puer tea[J].Agro Food Ind-ustry Hi Tech，2005，16（6）：16-18.

[21] 陈可可，朱宏涛，王东，等.普洱熟茶后发酵加工过程中曲霉菌的分离和鉴定[J].云南植物研究，2006，28（2）：123-126.

[22] 赵龙飞，徐亚军，周红杰.黑曲霉在普洱茶发酵过程中生长特性的研究[J].食品研究与开发，2007，28（10）：1-3.

[23] 方祥，陈栋，李晶晶，等.普洱茶不同贮藏时期微生物种群的鉴定[J].现代食品科技，2008，24（2）：105-108.

[24] 朱宏涛，杨崇仁，李元，等.普洱茶后发酵过程中微生物的研究进展[J].云南植物研究，2008（6）：718-724.

[25] 雷晓燕.普洱茶中主要微生物的研究[J].沈阳化工学院学报，2009，23（2）：134-137.

[26] 畢廷菊，罗娅婷，樊竹青，等.普洱茶渥堆发酵中真菌的分离与鉴定[J].现代农业科技，2014（10）：279-281.

[27] 董文明，谭超，付晓萍，等.5种成品普洱茶中微生物的分离及其产酶特性研究[J].食品科技，2013，28（8）：22-25.

[28] 周才碧，陈文品，吴钟玲，等.普洱茶优势菌株黑曲霉的分离及其功能和安全性研究[J].食品安全质量检测学报2015，6（3）：1006-1009.

[29] PACE N R.A molecular view of microbial diversity and the biosphere[J].Science，1997，276：734-740.

[30] ABE M，TAKAOKA N，IDEMOTO Y，et al.Characteristic fungi observed in the fermentation process for Puer tea[J].International Journal of Food Microbiology，2008，124：199-203.

[31] 吕昌勇.普洱茶渥堆发酵过程中微生物宏基因组学的测定与分析[D].昆明：昆明理工大学，2013.

[32] 赵明，张冬莲，袁文侠，等.普洱茶发酵过程微生物多样性的 454 pyrosequencing 研究[C]//昆明：第十六届中国科协年会：分12茶学青年科学家论坛论文集，2014：1-8.

[33] ZHANG W，YANG R J，FANG W J，et al.Characterization of therm-ophilic fungal community associated with pile fermentation of Pu-erh tea[J].International Journal of Food Microbiology，2016，227：29-33.

[34] 杨瑞娟，吕杰，严亮，等.普洱茶渥堆发酵中嗜热真菌的分离和鉴定[J].茶叶科学，2011，31（4）：371-378.

[35] 李晨晨，吕杰，杨瑞娟，等.普洱茶渥堆发酵过程中嗜热细菌的分离和鉴定[J].北京化工大学学报，2012，39（2）：74-78.

[36] 陈秀燕，陈松，郑华，等.普洱生茶优势菌种分离纯化及其对普洱茶品质影响初探[J].现代食品科技，2009，25（6）：604-607.

[37] 康燕山，黄薇，袁唯，等.普洱茶发酵过程中添加外源酶及外源酵母对主要成分的影响[J].云南农业大学学报，2015，30（5）：784-789.

[38] 王辉，李亚莉，苏丹，等.宏基因组学在普洱茶微生物研究中的应用[J].食品安全质量检测学报，2015，6（6）：2195-2200.

[39] 蔡元锋，贾仲君.基于新一代高通量测序的环境微生物转录组学研究进展[J].生物多样性，2013，21 （4）：401-410.

[40] 王兴春，杨致荣，王敏，等.高通量测序技术及其应用[J].中国生物工程杂志，2012，32（1）：109-114.

[41] 夏围围，贾仲君.高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J].微生物学报2014，54（12）：1489-1499.