芪参益气滴丸对肺心病大鼠心肌腺苷酸含量的影响

耿诗涵+单秋月+许梦习+张译丹++宋丽丽++侯宁+张闻+张密霞+庄朋伟+张艳军

[摘要]采用单次腹腔注射野百合碱（MCT）的方法复制大鼠肺心病模型，芪参益气滴丸浸膏灌胃给药6周后，通过HPLC检测大鼠右心肌组织中的腺苷酸（ATP，ADP，AMP）的含量，进而考察芪参益气滴丸对肺心病大鼠心肌能量代謝的影响。结果显示ATP，ADP，AMP达到良好分离；ATP，ADP，AMP在考察的浓度范围内，线性关系良好；加样回收率均在90%～108%；与模型组相比，高剂量给药组大鼠心肌中ATP的含量显著性升高，ADP的含量有升高趋势，AMP含量有下降趋势。提示芪参益气滴丸能够改善心肌组织能量代谢系统。通过HPLC，为测定心肌组织中ATP，ADP，AMP含量提供了一种快速、高效的定性定量分析方法，为生物样品中能量代谢相关含量的测定研究提供了参考。

[关键词]芪参益气滴丸； 肺心病； 能量代谢； HPLC； 含量测定

慢性肺源性心脏病（简称肺心病，PHD），属于中医学 “肺胀”、“喘病”、“水肿”等范畴，病机多为肺、脾、心、肾亏虚，进而引起痰、瘀、水潴留。益气养阴、活血通络是其基本治法[12]。芪参益气滴丸（QS）具有益气通脉、活血止痛的作用，在临床上主要用于冠心病和心力衰竭，且对肺心病也有一定的疗效，但对肺心病的治疗机制尚不明确[3]。肺心病后期可出现全心衰，心肌能量代谢底物利用变化，能量消耗增加，游离脂肪酸堆积，抑制糖酵解，使心肌能量代谢进一步恶化[45]。有研究表明，QS能通过增加心肌组织中ATP的含量来改善心肌能量代谢[6]。作者推测QS可能通过改善心肌能量代谢的途径从而对肺心病起到治疗作用，本实验对此进行了研究。

1材料

岛津高效液相色谱仪（日本岛津公司）；电子分析天平（BT125D，赛多利斯科学仪器有限公司）；超声破碎仪[Biosafer250up，赛飞（中国）有限公司]；超速离心机（sigma3k15，北京五洲东方科技发展有限公司）；超声清洗仪（KQ500E，昆山市超声仪器有限公司）。

QS浸膏（黄芪、丹参、三七、降香，天士力制药集团股份有限公司）；野百合碱（MCT，GR132140225，南京广润生物制品有限公司）；色谱纯乙腈（500 mL，天津市康科德科技有限公司）；三磷酸腺苷二钠，二磷酸腺苷二钠，5′腺嘌呤核苷酸二钠盐（批号20151104，北京索莱宝科技有限公司）；氢氧化钠，磷酸二氢钾，氢氧化钾（500 g，分析纯，天津市化学试剂供销公司）；高氯酸（天津市化学试剂供销公司）。

40只雄性Wistar大鼠，180～200 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK（京）20120001。

2方法

21实验动物饲养

饲养于天津市放射医学研究所，温度（22±2） ℃，湿度（60±5）%。饲料为标准鼠粮，自由摄食饮水。

22实验动物分组

将40只大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组：对照组（C，n=10），模型组（M，n=10），QS低剂量组（L，n=10），QS高剂量组（H，n=10）。

23肺心病模型的复制

无水乙醇和生理盐水（2∶8）混合液将MCT配成1%的溶液备用。大鼠适应性喂养1周后，M，L，H组单次腹腔注射MCT（60 mg·kg-1），C组腹腔注射相应体积的生理盐水。

24给药方法

造模次日起，L组灌服2倍临床等效剂量的QS浸膏（945 mg·kg-1），H组灌服4倍临床等效剂量的QS浸膏（189 mg·kg-1），C和M组灌服相应体积生理盐水，每日1次，连续给药6周后进行药效学研究。

25大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP的测定

251对照品的制备

称取ATP对照品111 mg，ADP对照品096 mg，AMP对照品119 mg，分别加蒸馏水定容至1 mL，各取3种储备液一定量混合后得混标溶液，4 ℃避光保存，备用。

252样品的制备

取大鼠右心肌组织约200 mg，按心肌组织质量高氯酸溶液（042 mol·L-1）体积 1∶5加高氯酸溶液，在溶液中剪碎心肌组织，于4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，加入KOH溶液（05 mol·L-1）调节pH在60左右，静置5 min，同条件下离心10 min，取上清液，过022 μm微孔滤膜，得到样品溶液[78]。

253色谱条件

Venusil MP C18色谱柱（46 mm×150 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）磷酸盐缓冲液（B，pH 61），梯度洗脱，0～20 min，0% A，20～30 min，0%～60%A，30～45 min，60%～0%A；柱温为室温；流速1 mL·min-1；检测波长254 nm；进样量20 μL。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。

26统计分析

实验数据均以±s表示，应用SPSS 170统计软件进行分析，ANOVA做不同组之间差异比较，P<005时为显著差异。

3结果

31高效液相色谱法方法学考察[9]

311专属性

ATP，ADP，AMP对照品进样后保留时间分别为74，92，178 min。

312线性关系考察

分别将储备液稀释2，4，8，16，32，76，900倍，制成系列对照品溶液。测定峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，结果见表1。

313检测限与定量限

将对照品储备液用蒸馏水逐级稀释，进样测定，4讨论

本实验通过改变不同的色谱条件，以及样品处理过程中的变量因素，筛选并建立了一种快速测定大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP含量的高效液相色谱方法，并且在此色谱条件下对ATP，ADP，AMP的检测进行了全面的方法学考察。

参照文献[1012]，采用磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾，氢氧化钠，蒸馏水）为水相，比较有机相甲醇和乙腈，使用乙腈时柱压相对平稳，减少磷酸盐缓冲液对高效液相色谱仪的损伤；通过改变两相的比例，找出样品出峰的最佳条件。空白样品中的峰为流动相梯度改变程度大所致，ATP，ADP，AMP在这个峰之前出峰，对样品分析没有干扰。比较水相pH为56，61，66时样品的色谱图，发现pH为61时，ATP，ADP，AMP出峰时间合理且分离度较好，故调整水相的pH为61。最佳色谱条件为有机相采用乙腈；流动相梯度0～20 min，0%乙腈；20～30 min，0～60%乙腈；30～45 min，0%乙腈；调节水相pH为61。

样品处理过程中，比较剪心肌组织次数的不同（200，300，400，500，600次）对3种成分含量多少的影响，发现随着剪切次数的增加，3种成分的含量逐渐增加，剪心肌500与600次3种成分的含量接近，故处理样品时剪切次数为500；使用超声匀浆破碎仪将剪碎的心肌组织制成匀浆液，结果发现与不使用匀浆破碎仪的相同样品比较，ATP含量减少，AMP含量增加，提示ATP发生分解，故不使用超声破碎匀浆的方法；用氢氧化钾溶液调节样品的pH，比较不同的pH（40，60，83）对样品出峰的影响，结果表明：3种不同pH样品的出峰时间与峰面积相似，pH越小，分离度越好，但溶液pH过低会对色谱柱造成一定的损害。故最后选用与流动相接近的pH 60。

肺心病是由支气管肺组织或肺动脉血管病变，肺血管阻力增加，血管内皮细胞增殖，肺动脉高压，使右心室负荷增加，长期慢性缺氧，呼吸系统反复感染，细菌毒素的作用，逐渐导致右心功能不全，继而发展成全心功能衰竭[1314]。心肌能量代谢障碍是肺心病的主要症状之一，目前主要通过西药的支气管扩张剂、抗生素、呼吸兴奋剂和抗心力衰竭的药物联合应用为主要的缓解办法，但不能从根本上治疗该疾病且具有一定的副作用[15]。芪参益气滴丸主要由黄芪、丹参、三七、降香4味中药组成[3]。临床上主要用于冠心病、心力衰竭、肺心病[16]、扩张性心脏病、慢性乙型肝炎、特发性肺纤维化、化疗引起心脏病并发症和糖尿病微血管病发症等[4]。本研究结果显示，通过野百合碱复制的大鼠肺心病模型，其心肌组织中ATP含量和EC下降，AMP含量升高，提示肺心病大鼠心肌能量代谢障碍；给予芪参益气滴丸治疗可以显著增加心肌组织ATP含量和EC，降低AMP含量，提示QS可能改变腺苷酸含量，通过改善心肌能量代谢的途径来治疗肺心病。

肺心病是一种常见的的呼吸系统疾病，严重者病情发展至右心衰甚至全心衰，且目前的西医临床治疗方法较难治愈。本研究表明心肌能量代谢的改善可能是QS治疗肺心病的关键途径之一，拓宽了QS的治疗与临床应用范围[1718]。同时本研究建立了一种高效液相色谱方法，可以快速、准确测定大鼠心肌组织中ATP，ADP，AMP的含量，为生物样品中能量代谢相关含量的测定研究提供了参考。

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[收稿日期]20160815

[基金项目]国家“重大新药创制”科技重大专项（2015ZX09501004001002）；国家中医药管理局中医药行业科研专项（201507003）；北京市中医药科技发展专项（JJ201453）