红花黄酮类成分累积量与功能基因表达水平的关联分析

吴沂芸++陈翠平+任超翔+吴清华+陈江+裴瑾

[摘要]记录并计算红花开花1～7 d的平均产量，采用HPLC检测红花中羟基红花黄色素A（HYSA）、槲皮素、柚皮素和山柰酚的含量，使用Realtime PCR检测chs，chi的相对表达量，并进行相关性分析。红花平均产量、HYSA和柚皮素的含量及基因表达量之间呈现相似的变化趋势。平均产量于开花第3天达到最大值，与HYSA含量存在较高正相关性（r=0756，P<005），与chi的相对表达量存在极高正相关性（r=0892，P<001）；柚皮素含量与chs的相对表达量存在较高正相关性（r=0766，P<005）。该研究为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。

[关键词]红花； 黄酮类成分； 平均产量； 功能基因； chs； chi

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L的干燥花，夏季花由黄变红时采摘，阴干或晒干[1]，是临床常用的活血化瘀要药。据统计，《中国药典》2015年版收载含红花的中成药达近百种。目前红花主产于新疆准噶尔盆地边缘、伊犁河谷地带，年产量达27×104～36×104 t，占全国红花种植面积和总产量的80%左右。

羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）、槲皮素（quercetin）、柚皮素（naringenin）和山柰酚（kaempferol）均为红花中的黄酮类成分，是活血化瘀的主要有效成分。黄酮类成分合成途径可分为2个阶段：第一阶段通过莽草酸途径和乙酸丙二酸途径合成黄酮类基本骨架前体物质——4香豆酰辅酶A（4coumaroylCoA）及丙二酰辅酶A（malonylCoA）。第二阶段是黄酮类代谢的关键步骤，即1分子4香豆酰辅酶A及3分子丙二酰辅酶A在各类酶的作用下形成醌式查尔酮类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物。查尔酮合成酶（chalconesynthase，CHS）是红花黄酮类成分生物合成途径的第一个关键酶，可形成具有C13架的黄酮类化合物——查尔酮，可作为中间产物进一步转化构成醌式查尔酮类和柚皮素[2]。查尔酮异构酶（chalconeflavononeisomerase，CHI）是红花黄酮类成分生物合成途径分支上的第一个关键酶[3]，可催化分子内的环化反应，使查尔酮类结构异构形成柚皮素，继而在各类酶的作用下形成二氢黄酮类、二氢黄酮醇类及黄酮醇类等化合物[4]。chs与chi分别在灯盏花、桑、决明等的研究中证明为黄酮类成分合成途径中的关键酶基因。

因此，本研究对开花1～7 d的红花进行平均产量、黄酮类成分动态累积量及功能基因相对表达量的检测，并进行关联性分析，为红花中黄酮类成分合成及调控机制研究提供理论依据，同时也为研究红花品质差异形成的分子机制奠定基础。

1材料

红花种子来源于四川省农业科学院——简阳市石盘镇中药材资源基地，种植于成都中医药大学药用植物园内，经成都中医药大学裴瑾教授鉴定为菊科植物红花C inctorius于2015年1月24日播种，2015年5月31日开花。于开花1～7 d每日上午8：00采摘，清洁并吸干水分后置冻存管内，立即放入液氮中速冻，带回实验室，一部分直接提取RNA，质量合格者反转录成cDNA，置-20 ℃冰箱中备用；一部分低温冷冻干燥24 h，IKA液氮打粉机粉碎，用于含量测定。

色谱纯乙腈、甲醇（美国Fisher公司）；分析纯磷酸（成都市科龙化工试剂厂）；超纯水（自制）；羟基红花黄色素A对照品（批号 MUST15072815，成都曼斯特生物科技有限公司）；Agilent 1200高效液相色谱仪（包括化学工作站）、Agilent 1260 DAD紫外检测器（美国 Agilent Technologies公司）；电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；2×Taq PCR Master Mix、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂（天根生化科技有限公司）；荧光定量PCR仪（美国BioRad公司）。

2方法

21红花平均产量计算

采摘开花1～7 d整个花序的管状花，随机取50朵长度15 cm左右的管状花，清洁并吸干水分后称重（M）；随机标记10个花序，于开花1～7 d每日对开放管状花进行计数，计算平均值（N）。计算红花平均产量（开花1～7 d每个花序管状花的平均质量）=M·N/50。

22HPLC测定黄酮类成分含量

221HYSA含量测定[5] 精密称取红花粉末04 g，精密量取25%甲醇50 mL，称量，25 ℃超声（300 W，50 kHz）处理40 min，取出后称重并补足失重。用045 μm滤膜过滤得供试品溶液。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇乙腈07%磷酸溶液（26∶2∶72）为流动相，等度洗脱；检测波长 403 nm；流速 08 mL·min-1；柱温 25 ℃；进样量 10 μL。

222槲皮素、柚皮素和山柰酚含量测定精密称取红花粉末10 g，精密量取甲醇25 mL，95 ℃回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过，精密量取续滤液15 mL，置平底烧瓶中，加盐酸溶液（取15～37 mL）5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。Agilent Zorbax Eclipse XDBC18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇04%磷酸溶液为流动相，梯度洗脱；检测波长 360，254 nm；流速 10 mL·min-1；柱溫 25 ℃；进样量 20 μL。

23chs基因表达分析[6] 查阅文献[3]，得到红花chs（上游引物5′GTCGTCCTCTTCGTTGTGGT3′；下游引物5′CAAAGGCGAAAAGACGATTC3′）和内参基因25s（上游引物5′GGAGGTTGAGGGAAAAGGAG3′，下游引物5′GTGACCTCGTCACCCGTAGT3′）的Realtime PCR引物序列。扩增体系10 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，5 μL；上游引物 05 μL；下游引物 05 μL；cDNA模板，1 μL；ddH2O，3 μL。考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察Realtime PCR条件（退火温度以50～65 ℃梯度考察）：94 ℃，3 min；30个循环（94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min）；72 ℃ 5 min。确定条件并测定红花chs和内参基因25s的表达量。

24chi基因表达分析[5] 查阅文献[7]，得到内参基因Ct60s（上游引物5′CATCCATTATCCAACAATC3′，下游引物5′AAGAGTAATCAGTCTCCA3′）的Realtime PCR引物序列。扩增体系20 μL：Thunderbird SYBR qPCR Mix，10 μL；上游引物 1 μL；下游引物 1 μL；cDNA模板 5 μL；dd H2O 3 μL。考察引物扩增曲线、溶解曲线及标准曲线，考察Realtime PCR条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s；Plate Read（52～60 ℃，30 s），40个循环；95 ℃ 30 s；Plate Read（65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s）。确定条件并测定红花chi和内参基因Ct60s的表达量。

25数据分析利用BioRad CFX Manager软件分析chs及chi的相对表达量。然后，利用SPSS 170统计学软件进行分析，考察平均产量、有效成分动态积累及基因表达水平之间的相关性。

3结果

31红花平均产量的计算对红花开花1～7 d的花序形态进行记录、描述，并对平均产量进行计算，结果见图1，表1。红花开花1～7 d管状花依次开放，3～4 d开放完全，并于5～7 d逐渐枯萎，颜色由浅黄逐渐加深为橘红。由表1可知，红花平均产量逐渐增大，于第3天达到最大值，后逐渐减小。

含量呈现相似的变化趋势，均在1～3，4 d（始花期至盛花期）逐渐增加至最大值，在3，4～7 d（盛花期至衰败期）逐渐降低。将红花平均产量与HYSA含量进行相关性分析可知，两者存在较高正相关性（r=0756，P<005）。综合本草记载及本研究认为：红花应于“夏季盛花期采摘，此时花朵由黄变红，管状花充分展开，花冠顶端金黄色、中部橘红色。”故于盛花期（开花3～4 d）采摘红花所得药材的平均产量和成分含量高、颜色红黄鲜艳、品质最好。

42chs和chi表达水平与黄酮类成分含量的相关性分析植物药材有效成分多为植物的次生代谢产物，是决定药材质量的物质基础；次生代谢产物与个体发育程度、组织分化相关，多受外界因素刺激通过影响生物合成基因表达而调控。生物合成功能基因调控有效成分积累，进而影响药材品质。本研究以红花开花1～7 d为研究对象，将红花中黄酮类成分动态累积量与2个关键酶的基因表达水平进行相关性分析，从而证实关键酶的催化作用，对于研究基因表达调控有效成分合成具有重要價值，同时为研究红花品质差异形成的分子机制奠定了基础。

红花中chs表达量与柚皮素含量的相关性较大，chi表达量与HYSA含量的相关性较大，因此，可以通过调节chs与chi的表达增加红花中柚皮素与HYSA的含量。chs表达量与槲皮素和山柰酚含量的相关性小，可能由于植物次生代谢产物的合成是一个复杂的系统，该系统受环境因子、调控因子等多种因素的影响，chs作为红花黄酮类成分合成路径上游的关键酶基因，影响因子逐渐增多，致使表达量与槲皮素和山柰酚含量的相关性变弱；将柚皮素与山柰酚的含量进行相关性分析可知，两者存在极高的正相关性（r=0019，P<001），而山柰酚是柚皮素在黄酮类成分合成途径下游酶的催化下合成的黄酮醇类化合物，说明柚皮素含量可对山柰酚产生影响。在今后的研究中，可进行红花各类成分合成下游基因的表达量研究，找出基因表达与成分的关联性，为有效成分合成及调控机制研究提供更多的信息。

[参考文献]

[1]中国药典一部[S]2015

[2]Koes R E，Francesca Q，Joseph N M The flavonoid biosynthetic pathway in plants：function and evolution [J]Bioessays，1994，16：123

[3]Huang L L，Yang X，Sun P，et al The first illumina based de novo transcriptome sequencing and analysis of safflower flowers[J] PLoS ONE，2012，7（6）：e38653

[4]Jez J M，Bowman M E，Dixon R A，et al Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalconeisomerasse[J].Nat Struct Mol Biol，2000，7（9）：786

[5]陈翠平，裴瑾，吴沂芸，等红花查尔酮异构酶基因的克隆分析表达及HSYA动态累积关系[J]中药材，2016，39（3）：499

[6]康亚兰，裴瑾，刘薇，等红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达[J]中草药，2014，45（14）：2385

[7]刘飞 红花黄酮类化合物生物合成途径关键酶基因的克隆与功能验证[D]上海：第二军医大学，2014[责任编辑吕冬梅]