中药肝毒性研究方法技术的新进展及其应用

宋捷+钟荣玲++夏智++吴豪++仲青香++张振海+韦英杰++石子琪++封亮+贾晓斌

[摘要]中药肝毒性问题受到了日益广泛的重视。目前，肝细胞系、亚细胞、三维培养、模式动物等体内体外模型在中药肝毒性的筛选中发挥着重要作用。随着现代系统观和整体论的引入，基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及网络毒理学等新方法开始逐步应用于中药肝毒性标志物挖掘和肝毒性预警等方面。该文通过总结近年来中药肝毒性研究领域的成果，分析和探討其中存在的主要问题，提出具有中医药特色的“结合病/证模型和网络毒理学的中药量效毒关系研究”的新思路，同时也对该课题组开展的淫羊藿潜在肝毒性的初步研究进行了概述，希望能为中药肝毒性的评价方法和技术指导原则提供理论基础，推动中药肝毒性研究体系的发展与完善。

[关键词]中药肝毒性；病/证模型；量效毒；网络毒理学；淫羊藿

肝脏是人体最大的“加工厂”，承担着生物合成、代谢转化以及分泌排泄等重要功能。药物进入体循环后，将经过肝脏代谢，因此肝脏是药源性损伤的主要靶器官之一。北京大学第一医院王贵强教授[1]指出，403%的药物性肝损伤为中草药所致。何首乌、菊三七、补骨脂、番泻叶、大黄等临床常用中药都已经被证实具有一定的肝毒性，重视中药肝毒性已是当务之急。

2010年版《中国药典》一部收载了中药材及饮片2 165种，其中标有毒性的只有83种，其中大毒10种，有毒42种，小毒31种。值得注意的是，本草古籍中提到的“毒”几乎全部指的是急性毒性；古人对于药物的慢性毒性认识，是一个薄弱环节，不过这也是由时代的局限性所导致的。现阶段临床上治疗心脑血管疾病和骨质疏松等疾病的中成药都需要长期服药，这势必对中药的安全性评价提出了更高的要求。因此，有必要对部分典型中药的安全性进行再评价，对中药的急性毒性、亚慢性毒性以及长期毒性有一个更为客观和科学的认识，明确其临床使用的安全窗；建立符合中医药特点的毒性评价体系，为中药的临床用药提供参考。

传统的毒理学研究通常以动物模型作为基础，实验周期较长，成本颇高。国际上常规的毒理学研究终点均因灵敏性、稳定性和特异性较差无法成为肝毒性早期诊断的标准。现有的临床前体外实验和体内实验的整体毒性预测率只有71%，有近30%的药物毒性是现有的临床前实验方法无法预测的。而随着分子生物学和现代分析技术的发展，越来越多的新技术和新模型已用于肝毒性的研究中，如干细胞诱导分化的肝细胞及亚细胞模型（快速、经济、直观地反映出药物对细胞及细胞器的影响），斑马鱼模型（检测药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄过程），三维培养模型（模拟肝脏细胞的空间结构并维持代谢酶的活性），毒理基因组学，毒理蛋白质组学（利用基因芯片和质谱联用技术找出新的生物标记物，构建肝毒性数据库），以上肝毒性检测手段的涌现极大的丰富了中药肝毒性评价体系的内涵，有助于进一步揭示中药肝毒性的机制，从而实现中药肝毒性的早期预警。鉴于此，笔者将针对近5年来国内外肝毒性研究体系的进展进行综述和分析。

1中药肝毒性评价的新模型及其应用

11常见的肝毒性评价细胞模型

常见的肝毒性筛选细胞系主要有人原代肝细胞，HepG2，L02，hiHeps，HepaRG细胞系等（表1）。HepG2细胞是最具有代表性和最常用的细胞系，细胞表面表达有丰富的IGFII受体，但是在标准培养条件下，细胞中功能性CYP450酶活很低，几乎检测不到。赵筱萍等[2]采用二乙酸荧光素荧光标记法在HepG2细胞模型上筛选木香中的肝毒性组分，结合GCMS联用技术，发现木香中所含的去氢木香内酯、珊塔玛内酯、瑞诺木烯内酯、α木香醇和榄香醇具有一定的肝毒性；L02细胞是一种正常人胚胎肝细胞，能够传代培养，常用作化合物肝脏毒性的体外研究模型。Lin等[3]通过测定L02细胞的活力，LDH渗漏率，酶活力，并结合UPLCQTOFMS技术，辨析出何首乌的肝毒性主要和蒽醌类以及大黄素等密切相关；hiHeps细胞是由人胚胎成纤维细胞分化而来，CYP3A4，CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9等代谢酶的活力和新鲜分离的肝原代细胞接近[4]；HepaRG细胞由人肝脏细胞分化而来，兼具肝细胞和胆管上皮细胞的特性，功能酶（CYP450酶，内质网酶，ABC转运蛋白）相对完整，具有双向分化能力。吴宇等[5]运用6种联合探针标记HepaRG细胞，双氯芬酸钠、盐酸丁螺环酮等药物的毒性充分体现，氧化应激、线粒体损伤、内质网应激以及钙稳态等指标的灵敏度也高于hiHeps，HepG2和L02细胞，提示HepaRG可作为高内涵细胞组学体外模型进行药物肝毒性筛选。

12干细胞诱导分化的肝细胞模型

121人胚胎干细胞模型由人胚胎干细胞诱导分化的肝细胞（human embryonic stem cellderived hepatocytes，hESCHep）建立的肝毒性评价体系，具有实验周期短、用药量少和有效避免种属差异等优点。hESC诱导分化3周即形成均一的、纯度较高的肝样细胞，具有肝细胞典型的形态结构并且可以检测到CYP450酶、有机阴离子转运多肽1B1、消除转运蛋白BSEP以及肝细胞特异性蛋白，如胞内酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和分泌白蛋白等的表达[67]。目前，该技术仅被少数实验室掌握，价格不菲，但其为肝毒性评价体系的完善提供了一个全新的方向。

122人多潜能干细胞模型诱导人多潜能干细胞分化成肝细胞（human induced pluripotent stem cellsderived hepatocytes，hiPSCHep），用凝胶固定培养，并将其与鼠胚胎成纤维细胞（3T3J2）、基质胶共培养建立微型图像化共培养平台（iMPCC），该体系可促进hiPSCHep的成熟并使其寿命延长至4周。hiPSCHep可应用于肝毒性的预测以及肝极性、白蛋白含量、P450酶活的检测[8]。Sullivan团队[9]诱导hiPSCs分化出具有肝脏功能的人肝内胚层，发现其可以用于药物毒性的筛选，以及CYP1A2和CYP3A4酶活的研究。Takayama等[10]建立了hiPSCHep的三维球体培养体系（3D hiPSCHep），采用WST8法检测肝毒性药物对细胞活力的影响，氯氮平、硝苯呋海因、他克林等药物作用后，3D hiPSCHep组的细胞活力均明显低于3D HepG2组，提示该模型的灵敏度要优于3D HepG2模型，更适用于肝毒性的早期筛选。

13亚细胞——高内涵分析

细胞经毒物作用受损或死亡时，其内部则表现为细胞器的损伤或病变，如线粒体、溶酶体、内质网等细胞器的损伤。荧光成像技术和高内涵分析（high content analysis，HCA）在亚细胞水平的筛选中应用日益广泛[11]。目前HCA能够实时、动态监测体外肝细胞毒性的多个参数、毒理學机制相关的多个重要的标志分子，主要包括细胞及亚细胞形态与数量、线粒体膜电位、氧化应激及DNA损伤，是评估和预测候选药物肝毒性的高效手段。Fu等[12]利用分离的大鼠线粒体和雷公藤甲素（triptolide，TP）共同孵育，发现TP可浓度依赖性的诱导线粒体的肿胀，增加线粒体渗透性，最终导致线粒体损伤。Wang等[13]运用4种探针（罗丹明123，Hoechst33342，表1常见的肝毒性评价模型

Table 1Hepatotoxicity evaluation models

体外模型优点缺点人原代肝细胞较好的体内外相关性，具有完整的代谢酶表达系统，适用于酶诱导实验分离复杂费时，存活时间短，部分CYP450 亚酶的表达量丢失，无法维持肝细胞的极性和代谢功能HepG2最具有代表性和最常用的细胞系，易于培养CYP450酶活很低，几乎检测不到L02是一种正常人胚胎肝细胞，具有典型的肝细胞形态学特征，常用于检测细胞活力、LDH渗漏率酶表达量低而且难于诱导hiHeps来源于人胚胎成纤维细胞，有成熟肝细胞的特性，代谢酶的活力和新鲜分离的肝原代细胞接近，兼具胆汁排泄的功能仅表达出部分的酶亚型；价格昂贵，难以获得HepaRG灵明度高，可进行肝毒性高内涵筛选，功能酶表达完整，双向分化能力细胞培养基较为特殊，价格不菲hESCHep实验周期短、用药量少、避免种属差异，可以检测到CYP450酶、有机阴离子转运多肽1B1、消除转运蛋白BSEP以及肝细胞特异性蛋白的表达hESC技术仍存在瓶颈，且仅被少数实验室掌握hiPSCHep可应用于肝毒性的预测以及肝极性、白蛋白含量、P450酶活的检测诱导分化培育出的肝细胞只有少数实验室可以完成，价格不菲亚细胞（高内涵分析）实时、动态监测体外肝细胞毒性的多个参数、毒理学机制相关的多个重要的标志分子检测敏感性和荧光探针对细胞活性的影响等方面有许多有待解决的技术难题精密肝切片包含肝组织内的所有类型的细胞，维持了肝腺泡功能和结构的完整性，在生化和生理功能上与活体肝相似，可在早期快速、高效的识别药物改变脂质代谢以及胆汁酸淤积药物不容易渗透到切片的内部，而且切片中心的细胞容易坏死；切片用的仪器很昂贵“三明治”模型同时拥有肝细胞形态和胆管的网络状结构，维持外排转运蛋白的功能性表达，可检测到白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白和尿素的表达原代肝细胞存活时间较短凝胶包埋肝细胞模型模拟体内细胞间微环境，保证代谢功能的长期维持肝细胞长期、高密度、高活性的培养方法有待进一步的改进微型中空纤维生物反应器细胞生长密度高、抗剪切力强、细胞活性好、细胞培养时间延长，合成产物易于提取，其中凝胶可为肝细胞提供三维立体支持作用生物反应器的结构和材料有待进一步优化斑马鱼模型幼鱼鱼体透明，可直接观察肝脏颜色、大小、胆汁淤积情况；肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，包括HMGCoA合成酶、裂解酶幼鱼给药方式多为药浴，和临床剂量没有直接的换算关系

宋捷等：中药肝毒性研究方法技术的新进展及其应用碘化丙啶，mitotracker）联合标记HepG2细胞，研究4种中药注射液的肝毒性。使用HCA技术以及荧光显微成像快速、敏感、高效的区分出了一种可能引起线粒体损伤的中药注射液（Fufang Kushen），所得结论和小鼠的亚急性毒性试验结果一致。肖小河团队[14]采用HCA二重探针标记法，检测何首乌与茯苓、甘草、三七在肝窦内皮细胞上的配伍减毒情况，研究发现何首乌对肝窦内皮细胞的损伤呈剂量依赖性，分别配伍不同浓度的茯苓、甘草、三七都有显著的减毒作用。其中，何首乌配伍茯苓减毒的效果较好，甘草次之，三七稍差。

14三维培养模型

141精密肝切片精密肝切片（precisioncut liver slice，PCLS）技术是介于器官与细胞水平之间的体外培养技术，可包含肝组织内的所有类型的细胞，维持了肝腺泡功能和结构的完整性，在生化和生理功能上与活体肝相似，近年来已应用于肝毒性的研究。PCLS模型可以在早期快速、高效的识别药物改变脂质代谢以及胆汁酸淤积的机制。Mukazayire等[15]使用PCLS模型简单、快速的区分出了3种致肝毒性的卢旺达草药，提示PCLS可用于大样本的肝毒性筛选研究。Vatakuti等[16]通过大鼠PCLS技术研究了四氯化碳的肝毒性，运用微阵列分析监测mRNA的早期变化、转基因组学实验测定αB晶状蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂的表达，最终发现了四氯化碳诱导肝纤维化的早期标志物。回连强等[17]将不同浓度的野百合碱与肝切片共同孵育24 h后，乳酸脱氢酶（LDH）的含量显著上升，蛋白水平下降，表明野百合碱会诱发一定的肝毒性。Szalowska等[1819]对具有潜在肝毒性药物进行了筛选，用四环素、丙戊酸、碘胺酮与小鼠PCLS共同孵育，经DNA微阵列基因转录分析发现碘胺酮和丙戊酸是过氧化物酶体增殖物激活受体PPARα/（β/δ）/γ的激动剂。

142“三明治”模型通过循环灌流法分离大鼠原代肝细胞，将其置于双层胶原之间培养，可建立“三明治”培养模型（sandwichcultured rat hepatocytes，SCRH）。传统的原代肝细胞培养方式无法维持肝细胞的极性和代谢功能，而SCRH可同时拥有肝细胞形态和胆管的网络状结构，维持外排转运蛋白的功能性表达，培养3个月均可检测到白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白和尿素的表达[20]。胆汁淤积性肝损伤在药源性肝损伤中占有较高的比率（>30%），各种胆汁酸是胆汁淤积性肝损伤的主要损伤因素，可直接破坏细胞脂质膜，甚至诱发细胞凋亡，同时介导中性粒细胞浸润，促进肝脏炎症反应。因此阐明胆汁淤积的相关机制是中药肝毒性研究的重要方向。SCRH已成为研究胆汁淤积和代谢酶诱导相互作用的主要工具之一。Zhuang等[21]研究发现Pgp抑制剂利托那韦显著减少了大鼠SCRH模型中雷公藤甲素（TP）的胆汁清除率，同时Pgp诱导剂明显增加了TP的胆汁清除率，提示胆小管膜表面表达的Pgp和TP可能会发生相互作用。Shen等[22]运用SCRH模型研究TP肝毒性的机制，结果显示CYP3A4诱导剂可以减轻TP的肝毒性，而抑制剂会加剧TP的肝毒性，推测CYP3A4介导的TP的代谢途径有可能是其解毒的机制。

143凝胶包埋肝细胞模型凝胶包埋肝细胞模型是一种三维拟组织化的体外肝细胞培养方式，可模拟药物体内作用情况。单层贴壁培养的肝细胞很快丧失肝分化功能，不能较好地反映肝脏脂质代谢情况。凝胶包埋肝细胞模型可以较好的模拟体内细胞间微环境，保证代谢功能的长期维持，孟琴团队[23]研究发现非诺贝特和平板培养肝细胞共孵育时，脂肪堆积和氧化压力均不明显，而凝胶培养肝细胞却表现出与体内相符的毒性反应，ROS和MDA等氧化应激标志物上升，过量脂质和脂肪堆积。因此，凝胶包埋培养细胞比单层培养细胞对药物的肝毒性更为敏感。该团队还在此模型上验证了利福平、四环素和硫唑嘌呤等20种药物的肝毒性[2425]。

144微型中空纤维生物反应器由具有活性和功能的肝细胞以及可供细胞培养的生物反应器构成，将肝细胞置于生物反应器内，药物通过半透膜与肝细胞进行生化作用[26]。沈冲等[27]证实该模型比单层培养肝细胞对对乙酰氨基酚毒性更敏感，这可能是因为中空纤维凝胶反应器具有较高的肝药酶活性。此外，在中空纤维反应器中，甘草和甘草酸也体现了一定的保肝作用。

15肝损伤潜在血清生物标志物

新的肝损伤生物标志物，如精氨酸酶、血清F蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶、苹果酸脱氢酶等[28]虽然受到了广泛关注，然而它们与ALT，AST一样，都是容易失去活性的蛋白质，而且敏感性和特异性有待进一步考证，从而限制了其临床应用。近年来，血清微小RNA（miRNA）为毒性的诊断开辟了一条新途径。有学者对19种具有潜在肝脏毒性的中草药进行临床前安全性评价，在观测体重、摄食量、血清生化指标、脏器系数与肝脏组织病理学改变的同时，探讨miRNA作为新型候选标志物在中草药肝损伤诊断中的应用价值。结果表明：与溶剂对照组相比，血清miRNA122水平显著升高的给药组有6组，而ALT和AST水平显著升高的分别为2组和3组，其中五倍子组表现为急性药源性肝损伤。在血清miRNA122的时间相关性和剂量相关性分析中，与血清ALT和AST相比，血清miRNA122呈现出更高的敏感性，表现为更早期和更大幅度的显著升高。说明血清miRNA122作为中草药肝损伤的新型候选诊断标志物，为中草药临床前安全性评价提供了新的参考依据。肖小河团队通过SIMCAP11软件进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLSDA），发现转氨酶等传统肝功能指标对生何首乌肝损伤作用不敏感，而血清直接胆红素，胆红素含量可在早期反映出何首乌引起的肝损伤[29]。毒理基因组学的快速发展也为肝毒性生物标志物的研究提供了新的技术手段。

16模式动物斑马鱼模型

斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度达87%，其信号传导通路与人类基本近似。斑马鱼胚胎透明，利于直接观察脏器的形态。斑马鱼最大限度地保留哺乳动物代谢的系统性，能体现Ⅰ相、Ⅱ相、肠菌及多途径代谢的综合结果，同时肝脏中有许多与哺乳动物同源的脂质代谢酶，包括HMGCoA合成酶、HMGCoA裂解酶和PPAR [30]。目前斑马鱼已被美国国家卫生研究院（NIH）列为继人和小鼠之后的第三大模式生物。2012年，辉瑞、默克和强生联合发表了一篇综述文章，肯定了斑马鱼模型在早期肝毒性筛选中的作用[31]。斑马鱼模型筛查肝毒性具有以下特色与优势：①灵敏度高，药物质量浓度单位μg·L-1至mg·L-1，尤其适用于中药微量成分肝毒性的评估；②高通量，实验在微孔板进行，适合批量筛选；③简单、高效，周期约为7～9 d[32]。正常斑马鱼肝组织清晰，He等[33]用解剖显微镜观察用四环素、丙戊酸、红霉素等肝毒性药物处理后的斑马鱼发现，肝组织明显变灰暗，并伴随卵黄囊肿大。张云等[34]建立了肝脏标记荧光的转基因（LFABP：EGFP）斑马鱼幼鱼，通过荧光显微镜观察对乙酰氨基酚的肝毒性。幼鱼成活率呈时间和剂量依赖性，对乙酰氨基酚组的幼鱼肝组织荧光强度明显弱于对照组，肝脏形态异常，肝脏颜色变暗，卵黄囊肿大。以上结果证明了斑马鱼模型用于肝毒性快速评价的实用性。斑马鱼取血通常采用背主动脉横切法（lateral incision），取血量少，对鱼体积要求高，给实验操作带来诸多不便。国外学者Vliegenthart[35]首次尝试后眼窝取血法，取血量翻倍，并且成功应用于斑马鱼血清miR122的检测。

2具有中医药特点的肝毒性评价体系的初步构建

安全是有效的前提，中药毒性评价及合理制用方法对学科和产业发展的重要性不言而喻。然后，当前中药肝毒性评价的认识理念和技术方法还不够完备，尚未形成一套符合中医药特点的、兼容并蓄的现代中药肝毒性評价及合理制用方法体系，已成为制约中药临床疗效发挥、安全用药的关键瓶颈问题。

21系统生物学和网络毒理学在中药安全性评价领域的应用

过去中药毒性评价主要运用病理学、生物化学、免疫学等技术对毒性靶点进行研究，其研究结果之间关联性薄弱，难以凝练出毒性的核心靶点。2007年英国学者Hopkins首次提出了网络药理学，以网络为基础，绘制药物靶点疾病三者之间的关系图。而基于组学技术的系统生物学的深入研究也加速了网络药理学的发展。范骁辉等[36]把系统生物学和网络药理学有机结合，提出了“网络毒理学”的概念，即通过整合网络搜索算法和毒性预测方法等相关软件，把已有的中药物质基础研究数据和毒理相关数据有机结合，建立可靠的毒理基因组学、毒理蛋白质组学等网络库，从而为药物毒性评价提供理论依据和技术支持。网络毒理学具有整体观的优势，它的出现无疑为中药这一复杂体系毒性的研究提供了一种可行的思路。把这种研究模式与体外毒性筛选系统相结合，将能够更全面、精确地预测和筛选有毒中药的毒性。 211基因组学基因芯片，又称为DNA微阵列，是由大量DNA或寡聚核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，可用于高通量监测肝毒性基因转录表达谱的变化。Luckert等[37]应用高密度基因表达谱芯片技术初步探讨了4种吡咯里西啶生物碱（蓝蓟定、天芥菜碱、千里光宁、千里光碱）的肝毒机制，结果提示吡咯里西啶生物碱可能通过改变脂质代谢与胆汁酸流动，以及抑制FXR，LXR，SREBF1/2和PPARα/γ/δ等转录因子而产生肝毒性。Panigrahi等[38]在研究决明子Cassia occidentalis种子时利用基因微阵列对比分析大鼠肝脏基因的表达谱，研究表明当大鼠饲料中添加05%～20%的决明子种子时，与氧化应激、异生物质代谢、凋亡等相关的基因表达失调，推测决明子种子的肝毒性可能和Ⅰ相代谢酶（甲氧基异酚恶唑O脱乙基酶）和Ⅱ相代谢酶（谷胱甘肽S转移酶）被抑制有关。

212蛋白质组学毒理蛋白质组学在中药肝毒性方面的应用主要是通过比较肝脏在药物作用前后的蛋白质表达谱的变化，在离体水平上更快、更准地筛选出毒性物质，并用于标志物和毒靶研究。Wei等[39]运用定量蛋白组学的方法寻找大鼠口服栀子苷后肝脏中的差异表达蛋白，进行图像灰度分析，候选出5个生物标志物，其中2个标志物甘胺酸甲基转移酵素和磷酸化酶比传统的标志物更早的预测出栀子苷的肝毒性。

213代谢组学肝毒性药物通过破坏细胞结构和功能导致内源性物质的稳态被破坏，代谢组学技术通过监测内源性代谢物的动态谱，可快速筛选出表征肝毒性的生物标志物，尤其适用于多通路多靶点的中药肝毒性复杂体系的研究。有学者从疑似何首乌肝中毒的患者血清中筛选出4个与肝损伤相关的标志物。何首乌灌胃第4周ALT和AST才有显著性改变；而上述代谢标志物在给药1周后不同组别间即有显著差异，可为临床早期诊断何首乌肝损害提供参考[40]。

214网络毒理学中药肝毒性的发生很可能是多靶点、多途径的，这种复杂毒性机制正好和网络毒理学的优势相契合。可从数据库中抽提出中药毒性靶器官的信息，借助可视化工具（Pajek，Cytoscape等）构建有毒中药靶点网络。比如，由范骁辉研究团队开发的基于全基因组学的转录组学数据库LTMap（http：//tcmzjueducn/ltmap），主要用于肝毒性的预测，已收录20 123例基因芯片的生物学信息[41]。此外还有LiverTox，TGGATEs，CTD，TOXNET等肝毒性相关数据库 [4243]。

虽然现阶段已涌现出丰富的毒性数据库，但笔者认为，在运用西方医学数据库构建中药毒性网络的同时应充分结合中医证候的特点；在中医理论的指导下，更好地开展中药肝毒性的研究。

22以病/证模型为基础诠释中药肝毒性

中药毒性的有无、大小均与机体的状态（即病/证）有关，即所谓的“有病就病受，无病则体受”。而根据中医“有故无殒”药物毒性理论，有毒中药只要使用对证，其毒性自然降低。熟大黄对健康大鼠具有一定的肝毒性作用，ALT，AST呈剂量依赖的增高趋势，肝脏病理切片显示大鼠出现纤维化改变，但对于四氯化碳诱导的肝损伤具有显著的护肝作用，在一定程度上验证了“有故无殒”之说和辨证用药减毒的科学性[44]。与正常动物比较，附子对寒证小鼠的LD50明显升高；附子对类风湿关节炎（RA）大鼠及RA+寒证大鼠心脏毒性的TD50明显升高；附子对RA+寒证大鼠（药证相符）的心脏毒性明显低于RA+热证大鼠（药证不符）。在病/证状态下，附子的毒性呈降低趋势，药效呈上升趋势，提示证候毒性药效之间存在一定的相关性[45]。但目前绝大多数有毒中药的安全剂量、毒性靶器官、中毒剂量等毒性信息源于生理状态的正常动物，并未涉及病理状态（包括病、证）对其毒性的影响，与临床实际应用有明显差异。因此，以疾病为基础、结合中医证候分类理论，能够使中药肝毒性评价更具针对性，也符合中医诊疗的实践过程与理论特色，为阐明量毒效关系和作用机制提供科学依据。

23“组分结构理论”为中药量效毒关系的研究提供了一种新的思路

中药重视“君臣佐使，七情和合”的组合形式，在辨证论治的基础上，整体把握病因以及疾病的发展变化规律，利用多味中药协调配合实现扶正祛邪的目的，从而使紊乱的机体系统调节至平衡状态。古人曾有“中医不传之秘在于量”之说，这种“量”的特征恰恰就是临床治疗窗安全范围的关键所在。某种成分可能在过量的情况下激活其他环节导致毒性，也可能在微量的情况下激活靶点的协同基因而增强药效。

有学者提出剂量是调控毒效关系的最重要因素，寻找疗效最大、毒性最小的最佳剂量是确定临床安全窗的重点。但是笔者认为中药是一个复杂体系，仅从剂量的角度不足以诠释中药“量”的独特内涵。药味的比例不同、单味药物质基础组成结构的差异，都可能产生无效或毒性的显著差别。中药物质基础“组分结构理论”中描述到中药是多成分构成的，这些成分并不是简单地堆积，活性成分按照理化及药理性质分为不同组分，可以有生物碱、皂苷、黄酮组分等，在生物碱组分内又分为苦参碱、吴茱萸碱等，单体成分作为基本功能单位；这些成分在组分内以及组分间都有一定的组成和量比关系，即结构特征，通过多靶点、多层次、多途径的整合产生药效。对于毒性，也存在同样的调控方式，只是这种调控超出了原有的平衡范围。不同的物质基础组成在产生药效作用的同时，也同样产生了毒性作用。例如，关于泽泻的肾毒性，一直存在不小的争议，同品种但不同产地的泽泻存在毒性差异[4648]，可能是成分的量比關系导致了毒性的差异。有学者开展了柴胡水/醇提物的毒性实验，发现其毒性较低（表现为ALT和AST的升高），但肝脏未见明显的病理变化。对上市中药小柴胡颗粒进行毒性再评价，同样没有观察到明显的肝毒性。但其主要成分柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2均可抑制肝细胞生长，作用强度为d>a>b2。在胃酸的作用下柴胡皂苷d易转化为b2，而柴胡皂苷b2的毒性明显低于d [49]。虽然柴胡的安全剂量远大于临床常用量，但其潜在的肝毒性不容忽视。加强柴胡药材的质控，明确皂苷组分量效毒的关系对于临床安全用药尤为重要。因此，“组分结构理论”为解释中药毒性差异提供了理论依据，也为进一步揭示毒性机制提供了切实可行的思路和方法。

24结合网络毒理学和病/证模型的中药量效毒研究思路的探讨

机体是一个复杂的生物网络，中医“证候”可能是蛋白质网络和基因调节网络被“扰动”后所发生的一种特异性变化状态。而中药的有效性或毒性与其对生物网络中心节点的干预有关。基于“组分结构”理论，中药的物质基础是一个多维多层次的网状结构，在组分间以及组分内都有相对确定的组成和量比关系。不同的组分/成分驱动体内相互关联的若干靶点群，当所产生的靶点效应被过度放大或调节失衡就有可能导致毒性效应。这种毒性效应，表现在靶器官靶组织靶分子损害的多个层次，呈现复杂的网络特征。网络毒理学是从“点（生物靶分子）线（途径）面（网络）”多个水平说明中药毒性事件链构成及其因果关系，避免以往单纯的化学药品或者简单的天然药物“一对一”的理论模式的不足，即一种药物引起一种毒效应或一种靶分子改变。结合了病/证模型的网络毒理学则是在中药干预对证机体过程中收集生物学信息，同时结合毒性相关数据库，整合信息之间的相互关系，以此构建与证候标志物、毒性标志物关联的中药成分毒性靶点网络。所构建的网络，通过网络映射、拓扑结构分析、网络聚类等方法从宏观层次分析中药毒性产生的机制。

研究人员逐渐认识到网络毒理学和病/症模型在中药毒性研究中的重要性，尝试着将两者结合运用到肝毒性的考察中。谭勇等[50]采用“氢化可的松造模法”建立肾阳虚证大鼠模型考察白附片对正常和肾阳虚大鼠的肝毒性差异。中医认为制附子入肾经、具有补火助阳的功效，这就可以解释同等剂量下白附片对正常大鼠的肝毒性更突出，在肾阳虚大鼠中肝毒性显著缓和。代谢组学的研究进一步发现，氧化磷酸化、氨基酸和脂质代谢异常是白附片干预2种状态大鼠代谢轮廓的差别所在。

基于上述的毒性评价技术和体系，本课题组也初步探索了临床常用中药淫羊藿的肝毒性机制。近年来，传统认为无毒的补益类中药淫羊藿的毒副作用屡见报端。文献报道淫羊藿总黄酮没有明显的长期毒性[51]，最大耐受量实验显示小鼠口服淫羊藿总黄酮最大耐受量相当于人临床日用量的1 440倍，提示淫羊藿总黄酮急性毒性很小[52]。但也有极个别文献提及到淫羊藿的肝毒性，如，给药3 d小鼠即出现呕吐、纳差、活动减少，给药15 d处死，可见肝脏脂肪变性，该作者同时推测淫羊藿的雄激素样作用和肝毒性密切相关[53]。此外，中国中医科学院西苑医院王停教授提出“基于基原用药部位工艺剂量疗程结合数学方法对淫羊藿肝毒性的研究”，该项目获得了2013年国家自然科学基金的资助（81374056）。临床上报道有肝毒性的中药复方中，仙牛健骨颗粒、壮骨关节丸、仙灵骨葆胶囊中均含有淫羊藿。本实验室基于斑马鱼模型也证实淫羊藿总黄酮高剂量组有一定的毒性。以上种种迹象提示淫羊藿可能是肝毒性的诱因。《本草纲目》中记载：淫羊藿，性温不寒，能益精气，真阳不足者宜之，阴虚而相火易动者忌服。中医强调辨证论治，以中医证候分类理论为基础，能够使淫羊藿肝毒性评价更具针对性。课题组既往采用代谢组学技术，运用正交偏最小二乘判别分析法研究了淫羊藿生品与炮制品对肾阳虚大鼠血浆代谢谱的影响。结果表明淫羊藿生品和炮制品干预后大鼠血浆代谢谱的轨迹均向正常组趋近，与淫羊藿生品组相比，炙淫羊藿能更好地调节肾阳虚大鼠体内的脂质代谢紊乱并使其回归至正常，初步揭示了炙淫羊藿补肾壮阳的增效机制[54]。不同病/证状态下药物的ADME差異性决定了有毒中药毒性的差异性，鉴于此，课题组对比了淫羊藿总黄酮在正常大鼠和骨质疏松模型大鼠中的代谢差异，淫羊藿总黄酮在骨质疏松大鼠的肠道菌群和十二指肠酶中的水解速率明显慢于正常大鼠，预示着其吸收和代谢进程也变缓慢，为后续的毒性研究和临床应用提供参考数据和设计依据。

3结语

近年来，现代科技迅速发展，各种质谱联用技术及核磁技术的应用使得国内外对中药肝毒性的机制研究不断深入，已逐渐由整体动物模型研究向细胞、分子水平延伸，并基于网络药理学构建了毒性中药数据库，取得了一定的研究进展。在药物研发的早期阶段，肝细胞、亚细胞和三明治培养等体外模型、模式动物斑马鱼等新的研究方法在肝毒性的高通量筛选中发挥着举足轻重的作用。尽管体外模型不能完全等同于体内模型，但是其高效的优势是体内模型不具备的。同时，它可以减少动物的使用量和实验经费，缩短实验周期，为从事药物开发的研究者提供科学的依据。而系统生物学因其特有的整体观优势，在中药肝毒性研究领域也有着广阔的应用前景，可用于肝毒性物质基础的辨析、毒性规律的探究，并为毒性标志物的筛选、毒性预测以及毒性数据库的建立奠定了基石。因此，建立恰当的证候对应的整体动物模型，从量效毒关系研究入手，采用代谢组学、网络生物学与网络药理学理论和技术诠释有毒中药对证控毒的科学内涵，将有可能探索出中药控毒研究的新思路与新方法。虽然网络毒理学的发展为中医药肝毒性的系统研究开辟了崭新的途径，但目前存在的问题也是不容忽视的。比如网络毒理学需要系统、真实、科学的数据库作为支撑，以及不断的动物试验和临床试验等来验证和丰富。

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