应重视血栓与出血的实验检测

王学锋

(上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025)

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应重视血栓与出血的实验检测

王学锋

(上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025)

国内实验室目前常规开展的血栓与出血检测项目，多数是基于纤维蛋白形成为终点的检测，对于不同出血病和血栓病诊断的敏感性和特异性有较大差异。血管性血友病因子(vWF)抗原、凝血因子Ⅷ活性、瑞斯托霉辅因子活性的检测可以诊断多数的vWD，但精确分型还需结合其他试验加以诊断和鉴别诊断。在凝血因子制剂替代治疗、华法林等药物抗凝治疗、溶栓治疗等方面，实验室检测可以判断药物治疗无效和药物拮抗过度。通过对遗传性出血病或血栓病先证者实施基因检测可以对家族中的疾病发生情况进行筛查。血栓与出血的实验检测可以为血栓病和出血病的诊断、疗效监测、个体化治疗及转化医学研究提供重要依据。

血栓病；出血病；血管性血友病；凝血因子缺乏；抗凝蛋白缺陷；纤溶系统亢进

血栓病和出血病是临床常见病和多发病，严重影响人类健康。血栓与出血的实验室检测可以为疾病的诊断、疗效监测、个体化治疗及转化医学研究提供重要依据。

1 筛选试验

目前，国内实验室常规开展的血栓与出血检测项目，多数是基于纤维蛋白形成为终点的检测。这些试验对于不同出血病和血栓病诊断的敏感性和特异性有较大差异。

1.1出血病 临床出血病最常用的筛选试验为凝血酶原时间(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)、纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)和血小板计数(platelet，PLT)。上述筛选试验对出血病诊断的敏感性和特异性较高，绝大多数出血病可以发现异常。出血时间在初期止血诊断中有一定价值，但其敏感性及特异性不甚理想，临床使用较为局限。PFA-100血小板功能分析仪是模仿机体一期止血而设计的检测装置，对初期止血功能缺陷的血小板数量和功能异常、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)等有较高的检测价值[1]。在此基础上升级改造的PFA-200血小板功能分析仪可以进一步监测抗血小板药物的有效性。血栓弹力图(thromboelastogram，TEG)可以用于评价整体凝血状况，但无法鉴别内源或外源凝血系统的异常，一般以即时检验(point-of-care testing，POCT)的形式服务于临床。

1.2血栓病 除部分血栓病患者可以有Fg升高，一般PT、APTT不甚敏感，仅少部分患者表现出该2项检测的异常。TEG在血栓病可以表现为凝血因子激活时间(R)缩短，最大振幅(MA)增大，血块形成时间(K)缩短和最大切角(α)增大，表现出较好的筛选价值。急性心肌梗死患者PFA-200血小板功能分析仪可以表现出闭孔时间(closure time，CT)缩短，并与心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTNT)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTNI)呈负相关。凝血酶生成试验(thrombin generation test，TGT)可以准确检测凝血酶的生成，在高凝状态和血栓病时具有较高的敏感性。

1.3抗凝血系统的异常 APTT可以检测出异常抗凝物质如狼疮抗凝物质、凝血因子Ⅷ(FⅧ)抗体等，但对于生理性抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin，AT)、蛋白C(protein C，PC)、蛋白S(protein S，PS)异常患者，无法检测到相应改变。凝血酶时间(thrombin time，TT)可以检测出体内类肝素物质增多。

1.4纤溶系统的异常 免疫比浊法检测纤维蛋白(原)降解产物(fibrin/fibrinogen degradation products，FDP)和D-二聚体(D-dimmer，DD)可以给临床提供信息。TEG在检测纤溶亢进时也有特殊的图形显示，在原发性纤溶和继发性纤溶的诊断与鉴别诊断时有一定价值。

2 确诊试验

2.1先天性凝血因子缺乏症 根据筛选试验提供的线索直接检测凝血因子可以明确疾病的诊断和鉴别诊断。vWD的发病率在所有遗传性出血病中最高，直接检测血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)抗原、FⅧ活性、瑞斯托霉辅因子活性可以诊断多数的vWD。精确的分型往往需要进行vWF多聚体分析、胶原结合试验、FⅧ和vWF结合试验等加以诊断和鉴别诊断。对APTT延长、所有凝血因子检测均正常、APTT纠正试验阳性的情况，可以直接扩增激肽释放酶原(prekallikrein，PK)和高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)的DNA。需要注意的是，我国目前广泛使用的是凝血因子活性检测的一期法。在FⅧ活性检测时，多数情况下，一期法的结果和二期法吻合。但一些特殊情况下，如FⅧ基因突变，可以使二者结果出现差异[2]。

2.2抗凝蛋白缺陷 目前常用AT、PC、PS和组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)检测抗凝蛋白缺陷，一般先检测这些抗凝蛋白的活性，若有异常降低，再检测其抗原性。根据活性与抗原性的改变，可以将抗凝蛋白缺陷分为交叉反应物质(cross reacting material，CRM)阳性(CRM+)和阴性(CRM-)2种，前者代表分子结构改变所导致的功能异常，后者说明其合成减少。PS由于和补体C4结合蛋白结合后丧失活性，临床上多通过检测游离的PS来反映其抗凝活性。需要注意的是，并非所有的抗凝蛋白缺陷均可以通过目前的表型检测方法发现；同样，表型检测所发现的异常，并非一定有病理诊断价值。Ding等[3]发现的PC的Thr315Ala是一个功能获得性突变，导致PC在内皮细胞膜上被激活加速，而其灭活FⅧa和FⅤa的能力下降，但综合的抗凝功能仍较野生型增加。故虽然市售PC试剂检测具有该突变的受试者是一个Ⅱ型PC缺陷患者，但其功能获得性突变使其没有血栓的症状，表现为一个表观健康人。

2.3纤溶系统亢进 纤溶系统各成分的检测有助于了解纤溶系统功能亢进的原因。由于先前的检测方法复杂，很少应用于临床。日前，化学发光法将纤溶系统多个标志物如组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂1复合物(tissue plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor-1 complex，t-PAIC)等应用于自动化检测中，大大提高了临床检测的效率。

3 疗效监测

疗效监测的主要体现：(1)在凝血因子制剂替代治疗后观察疗效，同时可以为围手术期个体化的精准止血方案提供实验依据。(2)华法林抗凝治疗时用国际标准化比值(international normalized ratio，INR)监测已经为众多医师所认可。肝素和低分子肝素抗凝治疗时，需要了解AT水平以避免肝素抵抗，监测抗FⅩa水平以达到最佳抗凝效果并避免出血风险，检测肝素-血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)复合物抗体和PLT以避免肝素诱导的血小板减少症/血栓形成。但这些检测却为广大的医务工作者所忽视。(3)监测FDP和DD水平可以观察溶栓治疗药物的效果,监测PLT和Fg水平有助于减少出血风险。(4)抗血小板治疗监测有传统的光学法血小板聚集试验、verifynow 的POCT检测、VASP流式细胞术检测及TEG的血小板图检测等多种方法学，各有其特点及优势。

通过检测可以发现药物治疗无效和药物拮抗过度的患者，有利于及时调整用药以达到最佳的抗栓效益和最低的出血风险。

4 药物基因组学检测

由于个体参与药物代谢的基因多态性的差异，患者对不同药物的敏感性不同。通过药物基因组学的检测，有助于了解药物在患者体内的代谢情况，真正做到精准用药。目前常用的主要有华法林和氯吡格雷的药物基因组学检测,可以根据药物基因组学检测结果及时调整临床用药，以获得最大的治疗效果而最大程度避免药物不良反应的发生。

5 项目的优化组合检测

血栓与出血项目的检测对于发现凝血紊乱，其敏感性和特异性不同。例如，对弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)的诊断来说，敏感性高的如APTT、PT，特异性不强；反之，对DIC诊断特异性高的，如Fg和破碎红细胞等，则敏感性堪忧。因此，DIC诊断时的项目优化组合，在各个项目优势互补的前提下，可以使疾病的诊断效率大大提高。

6 基因检测

遗传性出血病与血栓病多为单基因疾病，通过对先证者实施基因检测可以对家族中的疾病发生情况进行筛查。血友病为最常见的遗传性出血性疾病，为FⅧ/FⅨ的数量或功能异常所导致。上海交通大学医学院附属瑞金医院通过直接检测FⅧ/FⅨ基因缺陷，联合FⅧ/FⅨ基因内外多个位点的多态性进行遗传连锁分析，已成功实施1 700余例，鉴别出正常胎儿、女性携带者及血友病患者[4]。

遗传性血栓病的基因诊断同样可以为部分血栓病患者找到病因，以指导诊断及优生优育。瑞金医院将凝血因子、抗凝蛋白及有关纤溶因子及无表型检测(PROCR、THBD、ADAMTS13、HRG、SERPIND1、TFPI)的相关基因计15个组成检测panel，通过二代测序、基因拷贝数变异(copy number variations，CNV)检测及cDNA检测，发现入组的血栓病患者除42.4%由单基因突变导致外，27.25%由双基因突变、11.1%由三基因突变导致，多数由数个不同的基因缺陷导致，26.25%尚未发现基因突变。

7 表型结合基因型的诊断

表型结合基因型的诊断策略可以使血栓病和出血病的诊断更加精准。Liang等[5]将此策略用于vWD的诊断，可以使疾病的亚型分类更加精细，除发现部分患者同时有几种亚型的表现，还发现少数患者同时合并有血友病A。另外，女性血友病A患者非常罕见。陆晔玲等[6]结合表型与基因型的诊断策略，诊断出3个血友病A女性患者。

8 转化医学研究

血栓病和出血病是转化医学研究的极好对象。通常情况下，当凝血因子基因发生功能缺失性突变时，往往会造成出血病；反之，当抗凝蛋白基因发生功能缺失性突变时，往往可以造成血栓形成。然而，凝血因子的功能获得性突变可以导致患者血液凝固性异常增高，导致血栓形成。上海交通大学医学院附属瑞金医院在日常工作中发现一位静脉血栓患者的FⅨ的基因1151G/A突变导致FⅨ氨基酸替换，即FⅨ Arg384Gln FⅨ R384Q(含信号肽编码)或FⅨ R338Q(经典编码)。突变后的FⅨ的凝血活性较野生型高出5倍。这是继FⅨ Arg384Leu FⅨ Padua后人类发现的又一个凝血因子的功能获得性突变。前者已经成功地应用于血友病B的基因治疗并获成功。后者被本课题组命名为FⅨ Shanghai，通过AAV8载体已经在血友病B小鼠中获得了长期的高表达。期待FⅨ Shanghai作为具有独立知识产权的突变在血友病B的基因治疗上有所突破。除此之外，FⅨ Shanghai所表达的FⅨ有望与清蛋白或免疫球蛋白的Fc端结合，形成高效的半衰期长的凝血因子制剂。

血栓与出血的深入研究，不仅给疾病的诊断与治疗带来了巨大的改进，也为疾病发病机制的研究及转化医学研究提供了更加广阔的平台。

[1]Lassila R.Platelet function tests in bleeding disorders[J]. Semin Thromb Hemost, 2016,42(3):185-190.

[2]Joachim JP, Michael D, Andreas H. One-stage vs. chromogenic assays in haemophilia A[J]. Eur J Haematol, 2014, 94(Suppl 77):38-44.

[3]Ding Q, Yang L, Dinarvand P,etal.Protein C Thr315Ala variant results in gain of function but manifests as type Ⅱ deficiency in diagnostic assays[J].Blood, 2015,125(15):2428-2434.

[4]Dai J,Lu Y, Ding Q,etal.The status of carrier and prenatal diagnosis of haemophilia in China[J].Haemophilia, 2012,18(2):235-240.

[5]Liang Q, Qin H, Ding Q,etal. Molecular and clinical profile of vWD in a large cohort of Chinese population: application of next generation sequencing and CNVplex®technique[J].Thromb Haemost,2017,117(8):1534-1548.

[6]陆晔玲，丁秋兰，戴菁，等.FⅧ基因内含子22倒位及X染色体非随机灭活导致的女性血友病A[J].中华检验医学杂志，2008，31(5):528-532.

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.02

王学锋，1963年生，男，教授，主任医师，博士，主要从事出血病、血栓病的诊治工作和研究，E-mail：13641653074@139.com。

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