石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究

2017-03-06王娇娇赵帆帆李丽丽李建晨段志清

河北科技大学学报 2017年1期

哈婧，王娇娇，赵帆帆，李丽丽，李建晨,段志清

(1.河北科技大学化学与制药工程学院，河北石家庄 050018；2.河北省药物分子化学重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，河北石家庄 050018；3.河北医科大学第一医院，河北石家庄 050051)

哈婧1,2，王娇娇1，赵帆帆1，李丽丽1，李建晨1,2,段志清3

为建立石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱的测定方法，采用Inertsil®ODS-2C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，检测波长为265nm，柱温为30 ℃，流动相为甲醇-0.5%(体积分数)甲酸水溶液，梯度洗脱，流速为1.0mL/min，进样量为10μL。利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A对10个批次的石韦配方颗粒进行了相似度评价，并对其特征色谱峰峰面积进行了聚类分析。通过与标准品对比，确证了其中的2个色谱峰；通过多点校正及自动匹配，分析确定了9个特征峰；10批石韦配方颗粒的特征图谱相似度均大于0.85，通过聚类分析可将样品分为3类。该方法准确可靠，重复性好，可用于石韦配方颗粒的质量控制。

色谱分析；中药化学；石韦配方颗粒；特征图谱；质量控制

石韦为水龙骨科植物庐山石韦Pyrrosia sheareri(Bak.)Ching、石韦Pyrrosia lingua(Thunb.)Farwell或有柄石韦Pyrrosia petiolosa(Christ)Ching的干燥叶，具有利尿通淋、清肺止咳、凉血止血等功效[1]。现代药理学研究表明，石韦具有镇咳祛痰[2-3]、降血糖[4-5]、抗病毒[6]、增强免疫力[7-8]、增加白细胞[9-10]、抑菌等作用。植物化学研究表明，石韦中主要含有有机酸、黄酮类、三萜类、呫酮类、甾体及挥发油成分[11]。

几千年来，汤剂是中药最常用的剂型。传统中药汤剂对煎药用具、用水、火候、时间、特殊煎煮方法等都有严格的要求[12-16]。随着现代社会的发展、科技水平的提高，中药汤剂已不能满足现代人快节奏的生活方式，中药配方颗粒[17-24]应运而生。中药配方颗粒避免了繁琐复杂的煎煮工序，便于服用、贮存、携带，且安全卫生。目前石韦配方颗粒的质量控制多集中在性状、粒度、水分、溶化性、浸出物以及含量测定方面，缺少行之有效的反映其药效物质基础特征的质量控制方法。有文献报道采用HPLC对石韦配方颗粒中的绿原酸、咖啡酸及芒果苷进行含量测定[25]，但未见其关于HPLC-DAD特征图谱的报道。中药特征图谱[15,26]是一种综合的、可量化的鉴定手段，可用于鉴别中药配方颗粒质量的真实性、优良性和稳定性，能较全面地反映其化学成分的种类与数量，进而对其质量进行整体描述和评价。本实验采用HPLC-DAD建立石韦配方颗粒的特征图谱，综合运用相似度分析和聚类分析方法对石韦配方颗粒进行分析，为全面严格控制石韦配方颗粒的质量提供有效的方法和科学依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

LC-10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津公司提供)，包括LC-10ATVP色谱泵、SPD-M10AVPDAD检测器、SIL-10ADVP自动进样器、CLASS-VP色谱工作站；KQ-250B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司提供)；AL204型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司提供)；粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司提供)；药典筛(新乡市同心机械有限责任公司提供)。

甲醇(色谱纯，瑞典欧普森公司提供)；水(杭州娃哈哈集团有限公司提供)；其他试剂为分析纯。绿原酸(中国药品生物制品检定所提供，批号为110753-201314)，芦丁(中国食品药品检定研究院提供，批号为100080-201408)。

1.2 样品

石韦配方颗粒由10批石韦药材经提取、浓缩、干燥及成型工艺制得。10批石韦药材均来自河北安国东方药城，经河北省药品检验研究院段吉平老师鉴定为水龙骨科植物石韦，样品来源为贵州(SW-001，SW-002，SW-003，SW-004)、江西(SW-005，SW-006，SW-007，SW-008)、河南(SW-009，SW-010)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取绿原酸对照品5.0mg，精密称定，置于棕色量瓶中，用50%(体积分数，下同)甲醇溶解，配制成含绿原酸0.100 0g/L的对照品溶液。

取芦丁对照品5.0mg，精密称定，置于棕色量瓶中，用甲醇溶解，配制成含绿原酸0.100 0g/L的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取石韦配方颗粒粉末约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，超声(250W，40kHz)处理45min，放冷，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，取续滤液，制得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱为Inertsil®ODS-2C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇(B)-0.5%甲酸(A)，洗脱梯度：0～15min，11%～20%B；15～40min，20%B；40～55min，20%～38%B；55～80min，38%B；80～115min，38%～90%B；115～130min，90%～11%B；流速1.0mL/min；柱温30 ℃；检测波长为265nm；进样量为10μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法制备供试品溶液，连续进样6次，将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，以色谱峰8为参照，计算其他峰的相对峰面积，见表1。由表1结果可知，相对峰面积的RSD值均小于3%，说明该仪器的精密度良好。

表1 精密度试验结果(相对峰面积)

2.4.2 重复性

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法平行制备6份供试品溶液，梯度洗脱，记录色谱图。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，并以色谱峰8为参照，计算主要色谱峰的相对峰面积，见表2。由表2结果可知，各主要色谱峰相对峰面积的RSD值小于3%，说明方法的重复性良好。

表2 重复性试验结果(相对峰面积)

2.4.3 稳定性

以石韦配方颗粒(批号为SW-001)为供试品，按上述方法制备供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，15，18，24h梯度洗脱，记录色谱图。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，并以色谱峰8为参照，计算主要色谱峰的相对峰面积，见表3，由表3结果可知，主要色谱峰相对峰面积的RSD值小于3%，说明样品溶液在24h内的稳定性良好。

表3 稳定性试验结果(相对峰面积)

2.5 石韦配方颗粒特征图谱的建立与分析

2.5.1 石韦配方颗粒特征图谱的建立

按上述方法制备10批样品的供试品溶液，梯度洗脱，得到10批次石韦配方颗粒HPLC特征图谱，见图1。将所得色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A，得到11个共有峰，共有峰的总面积占总峰面积的90%以上，因此确定该11个色谱峰为石韦配方颗粒的特征图谱共有峰。

高血压是比较多见的一种慢性疾病,以老年群体为主,合并多种疾病。高血压患者的心肾脑肝等器官均会受到损伤,引起各种脏器的衰竭。患者血流动力学出现变化,血循环受到阻力,左心室出现代偿性肥厚,引起心衰,危急患者的生命安全,需要尽早的采取治疗措施。冠脉造影、心脏彩超是对高血压左室肥厚伴左心衰竭进行诊断的方式,心电图对早期的症状难以检测,冠脉造影费用高,有放射性,所以心脏彩超是常用的诊断方式。

2.5.2 参照峰及特征峰的确认

在10批次样品溶液的特征图谱中，峰8化学性质稳定，峰形佳，与其他峰分离良好，因此将其定为参照峰。通过与对照品图谱进行比对(见图2)，共确认了2个色谱峰，8号色谱峰为绿原酸、11号色谱峰为芦丁。

图1 10批石韦配方颗粒特征图谱
Fig.1 Characteristic chromatograms of 10 batches of Pyrrosia leaf formula granules

图2 石韦配方颗粒特征图谱
Fig.2 Characteristic chromatograms of Pyrrosia leaf formula granules

将10批石韦配方颗粒的特征图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A进行色谱峰匹配，获得的共有峰有11个，以所有共有峰作为特征峰评价石韦配方颗粒的真伪有可能造成误判。综合分析不同批次样品中各共有峰的峰面积及分离度，选定其中的2，3，4，5，6，8，9，10和11号色谱峰为石韦药材的特征峰，这9个特征峰具有良好的保留重现性。结果见表4。

表4 10批石韦配方颗粒特征图谱特征峰的相对峰面积

2.5.3 特征图谱相似度评价

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012A软件，对10批石韦配方颗粒特征图谱进行数据处理，结果见表5。由表5可以看出，S7和S10的相似度小于0.9，其他批次石韦配方颗粒的相似度均大于0.9。

表5 10批石韦配方颗粒特征图谱相似度结果

注：R为参照图谱。

2.5.4 聚类分析

采用SPSS19.0统计分析软件，对10批石韦配方颗粒的特征图谱进行聚类分析。以9个特征峰峰面积为变量，进行标准差为1的标准化处理，选择离差平方和法(Ward’smethod)为聚类方法，欧式距离法(Euclideandistans)为测量距离法，对数据进行聚类分析。系统聚类分析将样品分成了3部分，见图3。第1部分包括S1，S2，S4和S5；第2部分包括S7和S10；第3部分包括S3，S6，S8和S9。聚类分析结果与相似度评价结果一致，2种方法相互印证，表明利用系统聚类分析可以更好地对数据进行分类。

图3 聚类分析树状图
Fig.3 Dendrogram of cluster analysis

3 讨论

通过查阅资料可知，绿原酸和芦丁的最大紫外吸收波长为326nm和358nm。综合考虑石韦中的各化学成分，采用光电二极管阵列检测器(DAD)对样品进行190～400nm的全波长扫描，对不同波长下的色谱图中各类成分的出峰情况、峰形大小、吸收峰的数量及强弱进行对比分析，结果发现在265nm波长下检测时石韦中各化学成分可以很好地表达出来。因此选择265nm为检测波长。

本实验考察了3个不同的流动相系统，即乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸和甲醇-0.5%甲酸系统。结果发现，甲醇系统明显比乙腈系统出峰个数多且基线平稳，故本实验最终选择甲醇-0.5%甲酸系统。同时对柱温(25，30，35 ℃)进行了考察，由结果可知，柱温25 ℃时可获得最佳的分析效果，故最终确定了实验所需的色谱条件。

采用相似度对石韦配方颗粒的10批样品进行分析，结果表明，除批号S7和S10之外，其他8批样品的相似度系数均大于0.9。系统聚类分析的结果与相似度评价结果基本吻合，说明不同批次石韦配方颗粒的化学组成存在一定的差异。经河北省药品检验研究院段吉平老师鉴定，S7和S10中混杂着不同程度的有柄石韦和大叶石韦，与所测结果一致。本实验10批石韦配方颗粒均具有所标示的特征峰，说明建立的石韦配方颗粒特征图谱具有可行性。该方法专属性强、操作简便、稳定易行，为控制和评价石韦配方颗粒的内在质量提供了科学依据。

[1] 药典委员会. 中华人民共和国药典[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2] 包文芳, 孟宪纾, 周荣汉. 中国石韦属化学成分与分类学的研究(第1报)[J]. 沈阳药科大学学报, 1982(15): 62-71.BAOWenfang,MENGXianshu,ZHOURonghan.StudiesonchemicalconstituentsandTaxonomyofthepyrrosiamirbelinChina(Report1)[J].JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity, 1982(15):62-71.

[3] 邵绍丰, 张爱鸣, 刘耀, 等. 单味中药金钱草、石韦、车前子对大鼠肾结石肾保护作用的实验研究[J]. 浙江中西医结合杂志, 2009, 19(6):342-344.SHAOShaofeng,ZHANGAiming,LIUYao,etal.ProtectionEffectofChineseherbsChristinaLoosestrife,PyrrosiaandPlantagoonkidneyinjuryinthemodelofratcalciumoxalatestones[J].ZhejiangJournalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine, 2009, 19(6):342-344.

[4] 王兵, 黄传贵. 石韦多糖降血糖作用的实验研究[J]. 亚太传统医药, 2008, 4(8):33-34.

[5] 王楠, 王金辉, 程杰, 等. 有柄石韦的化学成分[J]. 沈阳药科大学学报, 2003, 20(6):425-427.WANGNan,WANGJinhui,CHENGJie,etal.ChemicalconstituentsofthePyrrosia petiolosa (Christ)Ching[J].JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity, 2003,20(6):425-427.

[6] 郑民实, 李文. 庐山石韦抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的实验研究[J]. 微生物学杂志, 1990, 10(1/2):73-76.ZHENGMinshi,LIWen.ExperimentinvestigationintoantiviraleffectofPyrrosiasheareri(Bak.)ontypeⅠherpessimplexvirus[J].JournalofMicrobiology, 1990, 10(1/2):73-76.

[7] 吴金英, 贾占红, 孙建宁, 等. 复方石韦片主要药效的实验研究[J]. 浙江实用医学, 2005, 10(5):311-313.

[8]WOLFFJM,BREHMERB,BORCHERSH,etal.Age-specificreferencerangesforprostatespecificantigenpopulationspecific[J].AnticancerRes, 2000, 20(6):49-81.

[9] 梅志洁, 李文海, 邓常青. 石韦大枣合剂治疗环磷酰胺所致小鼠白细胞减少症的实验研究[J]. 湖南中医学院学报, 2002, 22(2):32-34.

[10] 李文海, 刘淑余. 石韦大枣汤治疗白细胞减少症47例小结[J]. 湖南中医杂志, 1992,2(1):7-8.

[11] 陈丽君, 马永杰, 李玉鹏，等. 石韦属植物化学和药理研究进展[J]. 安徽农业科学, 2010, 39(10):5786-5787.CHENLijun,MAYongjie,LIYupeng,etal.AdvanceonthechemicalandpharmacologicalstudiesonplantsofPyrrosiagenus[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences,2011, 39(10):5786-5787.

[12] 李松林, 宋景政, 徐宏喜. 中药配方颗粒研究浅析[J]. 中草药, 2009, 40(1):1-3.

[13] 郭秀丽. 中药煎煮的方法[J]. 社区医学杂志, 2010, 18(8):18-21.

[14] 宋立人. 现代中药学大辞典[M]. 北京:人民卫生出版社, 2001.

[15] 高贝，程丹丹，辛晓伟，等.HPLC法测定有柄石韦及华北石韦中绿原酸和木犀草素的含量及不同浸提物的指纹图谱分析[J]. 中国野生植物资源，2015, 34(1):19-36.GAOBei,CHENGDandan,XINXiaowei，etal.DeterminationofchlorogenicacidandMignonetteinPyrrosia petiolosa (Christ)ChingandPyrrosia davidii (Baker)ChingbyHPLCandanalysisoffingerprintsfromdifferentextraction[J].ChineseWildPlantResources, 2015, 34(1):19-36.

[16]CAIHao,XUZhiwei,CAIBaochang.Studyonchemicalfingerprint-ingofcrudeandprocessedatractylodesmacrocephalafromdifferentlocationsinZhejiangprovincebyreversed-phasehigh-performanceliquidchromatographycoupledwithhierarchicalclusteranalysis[J].PharmacognosyMagazine, 2012, 8(32):300-307.

[17]FOTSIST,PEPPERMS,AKATASE,etal.Flavonoids,dietary-derivedinhibitorsofcellproliferationandinvitroangiogenesis[J].CancerRes,1997, 57(14):2916-2921.

[18]MEKHFIH,HAOUARIME,LEGSSYERA,etal.Plateletantiaggregantpropertyofsomemoroccanmedicinalplants[J].JournalofEthnopharmacology, 2004, 94(2):317-322.

[19]郝云芳, 倪艳, 李先荣. 中药配方颗粒的质量控制方法研究进展[J]. 药物评价研究, 2013, 36(4):307-310.HAOYunfang,NIYan,LIXianrong.ResearchprogressonqualitycontrolmethodsofChinesemedicinalgranules[J].DrugEvaluationResearch, 2013, 36(4):307-310.

[20] 赵叶东, 叶宏军. 中药配方颗粒剂与中药饮片药效学等效性研究[J]. 辽宁中医药大学学报, 2010, 12(1):227-229.ZHAOYedong,YEHongjun.ReviewofpharmacodynamicsequivalencebetweendecotionpiecesandformulagranulesoftraditionalChinesemedicine[J].JournalofLiaoningUniversityofTCM, 2010, 12(1):227-229.

[21] 陈昭, 毕晓黎, 邱宏聪，等. 中药配方颗粒剂质量控制研究现状及展望[J]. 中国民族民间医药, 2013,22(20):11-13.CHENZhao,BIXiaoli,QIUHongcong,etal.ApplicationsandperspectivesofqualitycontrolonTCMgranule[J].ChineseJournalofEthnomedicineandEthnopharmacy, 2013,22(20):11-13

[22]赵自明, 崔景朝. 中药配方颗粒研究进展(Ⅲ)——药效学研究概况[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(5):270-274.ZHAOZiming,CUIJingchao.ProgressofChinesemedicinaldispensinggranule(Ⅲ)：AnoverviewonpharmacologicalstudiesofChinesemedicinedispensinggranule[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae, 2011, 17(5): 270-274.

[23]赵帆帆, 王娇娇, 李丽丽，等.青风藤配方颗粒的制备及与传统汤剂的比较[J].河北工业科技,2016,33(6):479-483.ZHAOFanfan,WANGJiaojiao,LILili，etal.PreparationofformulagranulesofCaulis Sinomeniiandcomparisonbetweenformulagranulesandtraditional[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology,2016,33(6):479-483.

[24]李军山，陈钟，彭新华，等.杜仲不同炮制品配方颗粒的红外快速鉴别[J].河北工业科技,2016,33(6):503-508.LIJunshan，CHENZhong，PENGXinhua，etal.RapididentificationofdifferentprocessedproductsofEucommia ulmoidesformulagranulesbyFTIR[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology,2016,33(6):503-508.

[25]吴怀恩, 劳深, 王雯慧，等.HPLC测定石韦配方颗粒中绿原酸、咖啡酸及芒果苷的含量[J]. 中国实验方剂学杂志, 2010, 16(16):54-61.WUHuaien,LAOShen,WANGWenhui,etal.Determinationofchlorogenicacid,caffeicacidandmangiferininShiweidispensinggranulebyHPLC[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae, 2010,16(16):54-61.

[26] 刘魁, 陈向民, 戎欣玉，等. 酸枣仁药材的质量标准研究[J]. 河北科技大学学报, 2009, 30(2):103-108.LIUKui,CHENXiangmin,RONGXinyu,etal.Researchonqualitystandardofsemenziziphispinosae[J].JournalofHebeiUniversityofScienceandTechnology, 2009, 30(2):103-108.

Study of HPLC-DAD characteristic chromatogram ofPyrrosia leaf formula granules

HAJing1,2,WANGJiaojiao1,ZHAOFanfan1,LILili1,LIJianchen1,2,DUANZhiqing3

(1.SchoolofChemicalandPharmaceuticalEngineering,HebeiUniversityofScienceandTechnology,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBase-KeyLaboratoryofMolecularChemistryforDrugofHebeiProvince,Shijiazhuang,Hebei050018,China; 3.TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050051,China)

ThedetectionmethodofcharacteristicchromatogramofPyrrosialeafFormulagranulesbyHPLC-DADisestablished.TheanalysisisperformedonaInertsil®ODS-2C18column(4.6mm×250mm,5μm)withagradientmobilephaseofmethanol-0.5%formicacidataflowrateof1.0mL/min.Thedetectionwavelengthis265nm,thecolumntemperatureis30 ℃,andtheinjectionis10μL.TheSimilarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM (Version2012A)isusedforthe10batchesofPyrrosialeafformulagranulesqualityassessment,andclusteranalysisisobtainedbasedoncharacteristicpeaksindetectedsamples.Twopeaksareconfirmedbycomparisonwiththechromatogramsofthestandardsubstances.Ninecharacteristicpeaksarefoundthroughmultipointreviseandthesimilarityevaluationsystem.Similaritiesof10batchesofPyrrosialeafformulagranulesareallmorethan0.85andtheanalyzedsamplesaregeographicallyclassifiedintothreeclasses.Themethodhasgoodcharacteristicsandspecificityofaccuracy,reliability,andrepeatability,andcanbeusedforthequalitycontrolofPyrrosialeafformulagranules.

chromatographicanalysis；Chinesemedicinechemistry；Pyrrosialeafformulagranules；characteristicchromatogram；qualitycontrol

1008-1542(2017)01-0039-07

10.7535/hbkd.2017yx01007

2016-07-23；

2016-09-30；责任编辑：张士莹

河北省食品药品监督管理局科技项目(ZD2015025)

哈婧(1970—)，女，河北石家庄人，教授，博士，主要从事药物分离与分析方面的研究。

E-mail：hajing02@163.com

哈婧, 王娇娇，赵帆帆，等.石韦配方颗粒HPLC-DAD特征图谱研究[J].河北科技大学学报,2017,38(1):39-45.HAJing,WANGJiaojiao,ZHAOFanfan,etal.StudyofHPLC-DADcharacteristicchromatogramofPyrrosialeafformulagranules[J].JournalofHebeiUniversityofScienceandTechnology,2017,38(1):39-45.