CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义

彭仲华，梁亮科

骨巨细胞瘤（giant cell tumor of bone，GCTB）是一类临床常见的骨肿瘤，多见于20～40岁人群，女性发病率高于男性[1]。大多数GCTB为良性肿瘤，25%～50%的患者治疗后复发，少数进展转移至肺部，一些患者复发或放疗后转为恶性[2]。近年来肿瘤病因机制的研究成果表明，肿瘤血管生成与多种肿瘤的发生、发展和预后密切相关[3-4]，寻找合适的肿瘤分子标志物将有助于进一步阐明肿瘤的生物学行为。CD34是血管内皮细胞的特征性标志物，具有高再现性和稳定性；基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase，MMP-9）可间接降解胶原蛋白，标记后可用于研究内皮细胞的迁移和增殖[5-6]；增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）可以较好地反映细胞的增殖功能，是评价细胞增殖状态及恶性潜能的重要指标[7]；而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促进血管生长，与肿瘤的发生发展关系密切[8]。本文旨在观察CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在GCTB组织中的表达水平，分析其与患者年龄、性别、肿瘤大小、Jaffe分级及预后的相关性，为GCTB的诊断与治疗提供临床依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集佛山市中医院三水医院及佛山市中医院2010年1月至2017年1月收治的80例GCTB患者的临床资料，其中男38例，女42例。平均年龄34岁（12～60岁）。肿瘤组织取材部位：脊柱7例、尺骨2例、桡骨6例、骶骨11例、股骨24例、胫骨14例、髋骨8例、指骨8例。所有肿瘤组织均经活检明确诊断为GCTB，以4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，常规苏木精-伊红染色。根据Jaffe分级[9]：Ⅰ级26例、Ⅱ级42例、Ⅲ级12例。

1.2 试验材料、仪器和试剂

免疫组化染色试剂盒；浓缩型DAB试剂盒；PBS；抗原修复液；HE染色试剂盒；CD34鼠抗人单克隆抗体、VEGF兔抗人单克隆抗体、PCNA鼠抗人多克隆抗体、MMP-9兔抗人多克隆抗体。以上试剂均由武汉谷歌生物科技有限公司提供。

1.3 检测方法

将石蜡包埋的切片脱蜡脱水，PBS洗涤3次（2 min/次），获取抗原。PBS洗涤3次（5 min/次），3%过氧化氢室温下洗涤切片15 min，去除内源性过氧化物酶活性，然后再次用PBS洗涤3次（5 min/次）。室温下将其滴入5%山羊血清封闭溶液中静止30 min，除去多余液体。加入CD34（1∶100）、MMP-9（1∶100）、VEGF（1∶100）、PCNA（1∶100）抗体，4 ℃下保存过夜，37℃下孵育1 h后PBS洗涤3次（5 min/次），滴加生物素化二抗及过氧化物酶标记的抗体。PBS洗涤切片（3次，5 min/次），DAB试剂染色并在显微镜下观察。最后洗涤5～15 min终止显色反应，苏木精-伊红染色并计数。每张切片在高倍镜下观察5个不同视野内的细胞染色情况，以胞浆或胞膜浅黄色或棕黄色为阳性细胞。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x-±s）表示。计数资料以例表示，采用非参数秩和检验或卡方检验进行比较。CD34与MMP-9、VEGF、PCNA表达的相关性采用Spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD34、MMP-9、VEGF及PCNA在GCTB组织中的表达

2.1.1 CD34如图1所见，CD34阳性表达物（棕黄色表示阳性染色）定位于肿瘤间质小血管及微血管内皮细胞中。

2.1.2 MMP-9 MMP-9呈胞浆着色，阳性物质呈棕黄色，在GCTB中高表达，主要表达在多核巨细胞，部分单核基质细胞也有表达（图2）。

2.1.3 VEGF VEGF在GCTB中高表达，主要表达于肿瘤间质小血管及微血管内皮细胞中（图3）。

2.1.4 PCNA如图4所示，PCNA阳性表达于单核间质细胞的胞核内（棕黄色表示阳性染色）。

2.2 CD34、MMP-9、VEGF、PCNA的表达水平与GCTB临床相关参数的关系

CD34、MMP-9、VEGF、PCNA的阳性表达水

图1 CD34在骨巨细胞瘤组织中的表达（免疫组化染色×200）

图2 基质金属蛋白酶-9在骨巨细胞瘤组织中的表达（免疫组化染色×200）

图3 血管内皮生长因子在骨巨细胞瘤组织中的表达 3A免疫组化染色×200 3B免疫组化染色×400

对于GCTB而言，病理学评分和影像学表现平与GCTB患者的年龄、性别无明显相关性（P＞0.05），与肿瘤大小、Jaffe分级、预后之间存在显著相关性（P＜0.05），见表1～4。

2.3 CD34与MMP-9、VEGF、PCNA表达的相关性

CD34与MMP-9、VEGF、PCNA的表达呈正相关（r=0.311，0.424，0.401；P=0.015，0.025，0.025），提示CD34可能通过某种途径调控或影响GCTB患者MMP-9、VEGF和PCNA的表达水平。

3 讨论

GCTB属于局部侵袭性肿瘤，术后复发率较高，生物学行为往往与组织学外观不一致。在对GCTB病因机制的研究中，人们发现GCTB的生长和转移与血管生成密切相关，因此，从分子水平深入探究肿瘤血管生成相关基因和蛋白产物表达水平，可为诊断和治疗GCTB提供了新思路、新策略[10-11]。

3.1 CD34、VEGF、MMP-9以及PCNA在GCTB发生发展中的作用及临床意义

并不能准确预测患者的预后，因此，研究CD34等细胞因子表达水平与GCTB临床相关参数的关系，对于指导GCTB手术方案、正确评估患者术后转归具有重要的临床意义。

图4 增殖细胞核抗原在骨巨细胞瘤中的表达（免疫组化染色×200）

表1 CD34表达水平与GCTB临床相关参数的关系（例）

表2 MMP-9表达水平与GCTB临床相关参数的关系（例）

表3 VEGF表达水平与GCTB临床相关参数的关系（例）

3.1.1 CD34 CD34属于高度糖基化的Ⅰ型膜蛋白，在人造血干细胞和血管内皮细胞表面选择性表达[12-13]，是血管内皮细胞的特异性标志物[10]。其常与VEGF一起被用于肿瘤血管的研究。

3.1.2 VEGF作为血管生成的重要激活剂，VEGF可促进新生血管的形成[14-15]，从而为肿瘤的生长和转移创造有利条件。目前的研究证实，肿瘤细胞的生长、浸润和血行转移均与肿瘤新生血管的形成有关，而VEGF在血管内皮细胞的增殖、分化、迁移中起到了积极的促进作用。

表4 PCNA表达水平与GCTB临床相关参数的关系（例）

王华等[16]对69例GCTB患者进行随访研究，结果提示，CD34、VEGF与肿瘤预后密切相关；叶恒志等[17]亦指出，VEGF、MMP-9的表达与GCTB的血管生成、细胞增殖、转移及复发有关；韩跃虎等[18]也有类似发现，认为VEGF、PCNA和MMPs与GCTB肿瘤大小、Jaffe分级、预后之间均存在显著相关性。

3.1.3 MMP-9 MMP是金属蛋白酶家族中的一员，可降解细胞外基质中的各种蛋白和胶原成分，破坏正常的组织学屏障，在肿瘤浸润、侵袭和转移过程中扮演重要角色，因此与肿瘤的临床进展及预后显著相关[5]。其中MMP-9主要由巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞及炎症因子合成或分泌，生理状态下参与细胞外基质的代谢过程，并在骨组织改建、胚胎发育、损伤愈合及机体排异反应等生理过程中发挥作用，而其异常活化时常导致病理改变，除可降解细胞外基质，还能释放具有生物学活性的VEGF[19-20]。

Lozonschi等[21]指出MMP-9具有间接调节肿瘤血管生成的作用；Kumta等[10]则发现MMP-9在GCTB细胞中明显上调。Han等[13]的研究结果揭示GCTB患者MMPs表达水平与Jaffe分级关系密切；Zhou等[5]则发现，CD34和MMP-9与GCTB患者微血管密度（microvessel density，MVD）值呈明显正相关，且与恶性程度分级密切相关。MMP-9与GCTB局部复发的相关性目前也得到了有关研究的证实[13]。这些观点与我们的研究结果相一致，MMP-9与GCTB患者性别、年龄无关，而与肿瘤大小、Jaffe分级、预后之间存在显著相关性。

3.1.4 PCNA PCNA是一种细胞周期调节蛋白，可以反映肿瘤组织的细胞代谢水平以及肿瘤DNA、RNA的合成情况，其过度表达可提示肿瘤细胞分化、浸润、转移、复发和预后等生物学过程[13]。Saxena等[22]的研究结果提示，复发组（25例）GCTB患者较原发组PCNA增殖指数有明显增加，提示更高的细胞增殖水平与GCTB复发有关。本研究结果也证实了PCNA与GCTB肿瘤分级及预后之间存在相关性。

3.2 GCTB患者肿瘤组织CD34与VEGF、MMP-9、PCNA表达水平的相关性

我们的研究结果显示，CD34与GCTB肿瘤组织中MMP-9、VEGF、PCNA的表达水平呈正相关，而GCTB的生长和转移又与血管生成密切相关，因此推测CD34可能通过某种途径调控或影响MMP-9、VEGF、PCNA表达，最终介导骨巨细胞瘤的新生血管形成，促进内皮细胞的增殖和肿瘤边缘的进展，提示在临床上检测上述指标有助于判断肿瘤的侵袭性。

总之，CD34、MMP-9、VEGF、PCNA在GCTB的发生发展中担负着重要作用，其表达水平可作为辅助诊断、评估肿瘤恶性程度及评价预后的重要参考指标。

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