紫娟茶中花青素的抑菌性研究

戴妙妙，马红青，王婷婷，张晓峰

（上海市质量监督检验技术研究院，上海201114）

紫娟茶中花青素的抑菌性研究

戴妙妙，马红青，王婷婷，张晓峰

（上海市质量监督检验技术研究院，上海201114）

紫娟茶由含酸甲醇提取后，经过乙醚、氯仿的液液分配以及AmberliteXAD-7HP树脂的吸附洗脱，得到花青素粗提物。针对花青素提取物，采用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌对花青素提取物的抑菌作用进行了检测。试验结果显示，紫娟茶中花青素提取物浓度达到10%～20%时对金黄色葡萄球菌抑菌能力较强，其次是大肠杆菌，但对酵母菌无效果。本研究的结果为紫娟茶花青素的深入研究与有效开发利用，提供了必备的表征条件和理论依据，并有助于食品原料的深度加工和功能性检测方法的应用与开发。

紫娟茶；花青素；抑菌性

近年来随着合成与半合成抗菌素的增多和广泛使用，细菌耐药性问题日趋严重，已成为21世纪全球关注的热点。尤其是，食品在加工生产、运输储藏过程中极易受到食源性疾病的致病菌的污染。出于对食品安全的考虑食品行业一向反对在食品中添加化学合成抑菌剂，这使得业界对天然来源抑菌剂的应用越来越重视。

国内茶叶中罕见的品种——紫娟茶[1]，干茶色泽为紫色，汤色也为黑紫色，香气纯正，滋味浓强。其茶树是具有紫茎、紫叶、紫芽（紫色的芽尖）等特征的一种特异植株。紫娟茶中含有种类丰富的活性成分，其芽叶经过蒸馏得到的浸出物含量为44.58%，茶多酚（Tea Polyphenols）的含量为35.52%，咖啡碱（Theine）31.01mg/g，花青素29.14mg/g，黄酮类化合物12.82mg/g，锌30.25mg/kg，氨基酸总量346.19mg/g，儿茶素（Catechin）总量201.86mg/g，其中的花青素含量高出普通红芽茶（5mg/g～10mg/g）两倍[2]。根据云南茶研所研究分析证明，紫娟茶有降血压、降血脂、预防心脑血管疾病、抗高蛋白过敏及抗HIV宿主细胞功效等作用，并能缓解眼疲劳、预防视力下降等功效。其较高含量的锌、黄酮类和丰富的花青素是其呈现上述功效的主要物质。

当前作为稀有品种的紫娟茶在国内外少有研究报道，特别是其生理活性如抑菌性等鲜有具体的科学数据，本研究针对这些内容进行了探讨。以紫娟茶为原料，通过含酸甲醇提取后，经过乙醚、氯仿的萃取，再通过Amberlite XAD-7HP树脂的吸附洗脱，最后得到其花青素的粗提物，并对紫娟茶中花青素的抑菌性进行了研究，主要针对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌3种菌种。采用微生物检测的经典方法[3]抑菌圈测量进行检测。抑菌圈是在涂布特定试验菌的琼脂培养基内用抑菌物质行成立体球状扩散，形成的一个透明圈，使试验菌的繁殖受到抑制。抑菌性可以通过抑制细菌（革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌）、真菌、病毒等进行评价。这些方法都是目前国内外使用较广泛的研究手段，其稳定性及广泛的认知度广受研究者推崇。

希望通过本研究的试验探讨为我国茶产业的深加工以及功能性食品的研发提供一臂之力。

1 材料与方法

1.1 原料

紫娟茶（市售），于4℃冰箱保藏，待用。

1.2 仪器

CP214C电子天平：Ohaus；RE5203旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；FE20精密pH计：Mettler Toledo；HHS-21-4孔型电热恒温水浴锅：上海医疗机械五厂；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；90-1恒温磁力搅拌器：上海精科实业有限公司；LGJ-18C冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；P20、P100移液器：Gilson；XS105DU分析天平：Mettler Toledo；HZ-8812S水浴恒温振荡器：常州市凯航仪器有限公司；LT-CPS38D立式压力蒸汽灭菌器：立德泰勀（上海）科学仪器有限公司；LHP-150恒温恒湿培养箱：常州冠军仪器制造有限公司。

1.3 试剂

甲醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚均为AP纯：国药集团化学试剂有限公司；三氯乙酸（TFA）为HPLC纯（Aladdin）；Amberlite XAD-7HP大孔吸附树脂（Rohm& Haas)；营养琼脂斜面、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：青岛海博生物技术有限公司；84消毒液：北京柯林龙安医学技术有限公司。

1.4 菌种

ATCC25923金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、ATCC25922大肠杆菌（Escherichia coli）、ATCC 18790酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）均采购于（美国标准生物品收藏中心（ATCC））。

1.5 花青素的制备[4]

称取300 g紫娟茶叶于5 L烧杯中，加2%TFA甲醇浸提液至浸没茶叶，4℃下避光静置21 h，过滤收集滤液，残渣继续用2%TFA甲醇浸提液浸泡，4℃下避光静置4 h，收集滤液，共重复3次。合并3次浸提滤液，得到紫娟茶浸提滤液约4 L。4 L紫娟茶浸提滤液在35℃下旋转蒸发蒸去甲醇，直至无甲醇残留，得到紫娟茶粗提液约500mL，调节pH＜2。500mL紫娟茶粗提液，先用乙醚进行3次～5次萃取，每次乙醚使用100mL～ 200mL，直至有机层无色显现，收集水层，旋转蒸发除去乙醚，乙醚能除去紫娟茶粗提液中的脂质脂溶性色素等；再用氯仿进行3次～5次萃取，每次氯仿使用100mL～200mL，至有机相无色，取水层，旋转蒸发除去氯仿，水溶液浓缩至300mL，调节pH＜2，氯仿能除去紫娟茶粗提液中的咖啡碱。将300mL紫娟茶粗提水溶液以16mL/min的流速，缓慢滴入层析柱（Φ2.5 cm× 60 cm）中，静置20min～30min，使其充分吸附在树脂上[4]。先用1 L 0.1%TFA水溶液洗脱，除去一些水溶性的单糖、氨基酸等小分子的杂质；再用2 L 0.1%TFA甲醇溶液洗脱，直至无有色物质洗脱下来，收集洗脱液。将紫娟茶粗提洗脱液在35℃下旋转蒸发蒸去甲醇，直至无甲醇残留，再将其置于-60℃冷阱中冷冻6 h，随后在1.0Pa真空度下冷冻干燥18 h以上，得到紫娟茶粗提物27.6 g。称取上述20.0 g紫娟茶粗提物于烧杯中，加400mL乙酸乙酯，磁力搅拌30min，进行3次固液萃取，收集不溶固体，旋转蒸发蒸去乙酸乙酯，直至无乙酸乙酯残留，再将其置于-60℃冷阱中冷冻6 h，随后在1.0Pa真空度下冷冻干燥18 h以上，得到花青素粗提物4.3 g，于4℃冰箱保藏备用。

1.6 抑菌性的评价

1.6.1 培养基的制作[5]

1.6.1.1 营养琼脂培养基

称取营养琼脂斜面23.0 g于三角瓶中，加1 L去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH7.3±0.1，分装三角瓶中，在121℃高压灭菌15min，备用。该培养基中蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；琼脂是培养基的凝固剂。营养琼脂培养基的配方见表1。

表1 营养琼脂培养基的配方Table1 The formulation of the nutrient agar medium

1.6.1.2 PDA培养基

称取PDA 46.0 g于三角瓶中，加1 L去离子水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调节pH5.6±0.2，分装三角瓶中，在115℃高压灭菌20min，备用。灭菌好的培养基仅可重复加热熔化一次。该培养基中马铃薯浸出粉有助于各种霉菌的生长；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。PDA培养基的配方见表2。

表2 PDA培养基的配方Table2 The formulation of the PDA medium

1.6.2 菌种的活化

1.6.2.1 细菌

G+菌（金黄色葡萄球菌）、G-菌（大肠杆菌）：直接用无菌接种环取数环菌种放在营养琼脂培养基里，先在37℃，120 r/min转速下恒温摇床培养24 h，再涂板，于37℃，120 r/min转速下恒温摇床培养24 h，最后取单个菌落接在营养琼脂培养基里，在37℃，120 r/min转速下恒温摇床培养24 h，控制pH在7.2～7.4之间。

1.6.2.2 酵母菌

先恢复培养，将深冻菌种在水浴中溶解，用接种环接种到PDA培养基中，置28℃恒温培养箱中培养48 h，这个步骤也称为“复壮”。再从平皿中挑取菌种，接到PDA培养基中，于28℃，180 r/min转速下恒温摇床培养24 h。最后以1∶100（质量比）比例，将种子液接到PDA培养基中，以实施扩大培养。

1.6.3 菌种的培养

1.6.3.1 细菌

金黄色葡萄球菌（G+菌）、大肠杆菌（G-菌）：将活化后的菌种，用接种环挑取一环于营养琼脂培养基上，于37℃，120 r/min转速下恒温摇床培养24 h。再用适量灭菌生理盐水洗下，作为细菌107CFU/mL菌种液备用。

1.6.3.2 酵母菌

将活化后的菌种，用接种环挑取一环于PDA培养基上，置28℃恒温培养箱中培养2 d～3 d，至菌种生长良好。再用适量灭菌生理盐水洗下，作为酵母菌106CFU/mL菌种液备用。

1.6.4 样液配制

1%、10%、20%花青素水溶液：称取0.05、0.5、1 g花青素于烧杯中，加灭菌生理盐溶解至5 g，混匀备用。1.6.5滤纸片的制备

将吸水力较强而质地均匀的双层定型滤纸用打孔机打成直径6mm的圆形滤纸片，置洁净干燥的培养皿中，121℃高温灭菌20min，备用。

1.6.6 抑菌圈的测定

图1 抑菌试验的流程图Fig.1 The flow chart of antibacterial test

将高温蒸汽灭菌后的固体培养基加热熔化后，冷却至45℃～50℃，倒入培养皿中。待重新冷却凝固，正置在烘箱内烘干琼脂表面水分。把配制好的菌种液，振荡均匀，用无菌移液器吸取0.1mL菌种液滴加在培养基表面，将其均匀地涂布于平板表面。取无菌并干燥的滤纸片放在每个平皿中心，然后再用无菌移液器分别吸取10μL 1%、10%、20%花青素水溶液样液，垂直滴加到滤纸片上。再放入恒温培养箱中培养。细菌在37℃恒温培养箱中正置培养1 h后倒置培养24 h；酵母菌28℃恒温培养箱中正置培养1 h后倒置培养48 h。观察抑菌情况，并测量抑菌圈大小，每种菌种做2次平行试验，以抑菌圈的大小表征抑菌活性的强弱。以浸有无菌水滤纸片作空白对照，以浸有10% 84消毒液滤纸片作为阳性对照。以上操作均在无菌条件下进行。

2 结果与分析

2.1 花青素的制备

300 g紫娟茶叶，经甲醇粗提→浓缩→乙醚、氯仿萃取→树脂纯化，获得紫娟茶粗提物27.6 g深红色多酚类物质，提取得率为9.2%；再经乙酸乙酯萃取→冷冻干燥，得到花青素粗提物4.3 g深紫色花青素，提取得率为2.0%。由于花青素粗提物经过冷冻干燥的物理处理，所以随后的保存也必须为低温，用时方可恢复至室温；其次，因为花青素光稳定性较差，要保持鲜有的质性，必须避光保存。

2.2 抑菌性的评价

抑菌圈法[6]是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，在抑菌物质的周围形成透明圈，通过透明圈大小来评价抑菌效果，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、酵母菌的抑菌作用，抑菌圈的大说明抑菌明显，小则表示抑菌性较弱。抑菌效果比较见表3，抑菌圈直径比较见表4。

表3 抑菌效果比较Table3 Comparison of antibacterial effect

表4 抑菌圈直径比较Table4 Comparison of antibacterial ring

1%、10%、20%样液浓度金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酵母菌抑菌圈见图2、图3、图4。

图2 1%、10%、20%样液浓度金黄色葡萄球菌抑菌圈Fig.2 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Staphyloccocus aureus

图3 1%、10%、20%样液浓度大肠杆菌抑菌圈Fig.3 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Escherichia coli

图4 1%、10%、20%样液浓度酵母菌抑菌圈Fig.4 The antibacterial effect of 1%，10%，20% Saccharomyces cerevisiae

由表4所示，在对金黄色葡萄球菌的抑菌性试验中，当紫娟茶中花青素提取物浓度为1%时，抑菌圈大小无变化，说明无抑菌作用；当浓度在10%～20%范围时，抑菌圈大小为7.5mm和8mm，说明随浓度增大抑菌圈增大抑菌作用增强。在对大肠杆菌的抑菌性试验中，当紫娟茶中花青素提取物浓度为1%时，抑菌圈大小也无变化，说明无抑菌作用；当浓度在10%～20%范围时，抑菌圈大小为6.5mm和7mm，说明随浓度增大抑菌圈增大抑菌作用增强。在对酵母菌的抑菌性试验中，当紫娟茶中花青素提取物浓度为1%～20%时，抑菌圈大小都无变化，说明无抑菌作用。

此结果与J.Côté等[7]研究的蔓越莓汁对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显抑菌作用的结论相一致，并与Cigˇdem Uysal Pala等[8]研究的石榴汁对酵母菌无抑制作用但对大肠杆菌有强抑菌性的结论相一致。

3 结论

通过金黄色葡萄球菌（G+菌）、大肠杆菌（G-菌）、酵母菌3种不同的菌种进行抑菌试验，证明紫娟茶中花青素具有一定的抑菌性。试验结果表明，紫娟茶中花青素提取物浓度为10%～20%时对金黄色葡萄球菌（G+菌）的抑菌效果明显；对大肠杆菌（G-菌）抑菌效果较明显；对酵母菌抑菌作用几乎没有。

[1]杨兴荣,包云秀,黄玫.云南稀有茶树品种“紫娟”的植物学特性和品质特征[J].茶叶,2009,35(1):17-18

[2]蔡丽,梁名志,夏丽飞,等.“紫娟”茶外观表象差异研究[J].西南农业学报,2010,23(3):700-703

[3]G E Pantelidis,M Vasilakakis,G A Manganaris,et al.Antioxidant capacity,phenol,anthocyanin and ascorbic acid contents in raspberries,blackberries,red currants,gooseberries and Cornelian cherries[J].Food Chemistry,2007,102:777-783

[4]Cuevas-Rodríguez EO,Dia VP,Yousef GG,et al.Inhibition of proinflammatory responses and antioxidant capacity of Mexican blackberry(Rubus spp.)extracts[J].J Agric Food Chem,2010,58(17): 9542-9548

[5]周邦靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法[M].重庆:科学技术文献出版社重庆分社,1987:291-298

[6]郝涤非.微生物实验实训[M].武汉:华中科技大学出版社,2012: 157-159,81-82

[7]J Côté,S Caillet,G Doyon,et al.Antimicrobial effect of cranberry juice and extracts[J].Food Control,2011,22(8):1413-1418

The Study on the Antibacterial Activity of Anthocyanins from Zi juan Tea

DAI Miao-miao，MA Hong-qing，WANG Ting-ting，ZHANG Xiao-feng
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai201114，China）

Anthocyanins from Zi juan tea were exteacted by using acid-containing methanol as solvent and partitioned with ether and chloroform.The extract of anthocyanins was purified by Amberlite XAD-7HP chromatography.The antibacterial effects of anthocyanins extraction for Staphylococcus aureus，Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae were also tested.The results were that the concentration of anthocyanins in Zi juan Tea extract reaches 10%-20%of Staphylococcus aureus antibacterial ability was stronger，followed by Escherichia coli，but Saccharomyces cerevisiae has no effect.This study will provide scientific basis for developing and utilizating of Zi juan tea and contribute the depth of processing of food materials and functional application.

Zi juan tea；anthocyanin；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.007

2016-03-11

戴妙妙（1984—），女（汉），工程师，工程硕士，研究方向：产品安全研究。