准噶尔山楂叶抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性

刘伟，任艳利，让凤菊，何晓燕，欧阳艳

（伊犁师范学院新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验室，新疆伊宁835000）

准噶尔山楂叶抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶活性

刘伟，任艳利，让凤菊，何晓燕，欧阳艳*

（伊犁师范学院新疆维吾尔自治区普通高校天然产物化学与应用重点实验室，新疆伊宁835000）

采用超声提取不同月份准噶尔山楂叶，系统溶剂萃取其醇提物得到环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，分别测定其总黄酮含量，通过清除DPPH自由基、铁离子还原能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性评价准噶尔山楂叶不同提取物的体外抗氧化活性及降血糖活性。结果表明，准噶尔山楂叶各提取物均有不同程度的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中以总黄酮含量最高的乙酸乙酯部位（28.87mg/g）效果最佳，其对DPPH清除活性（IC50=0.026mg/mL）远强于阳性对照BHA（IC50=0.996mg/mL），α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50=191.71 g/mL）高于阳性对照阿卡波糖（IC50= 1 044.32 g/mL）。各提取物体外抗氧化和降血糖活性与其总黄酮含量呈正相关性，说明黄酮类化合物为影响其活性的主要因素。

准噶尔山楂叶；总黄酮；抗氧化；抑制-葡萄糖苷酶活性

糖尿病（Diabetes mellitus）是一种以胰岛素分泌绝对不足（I型）或相对不足（II型，胰岛素抵抗）而引起的以高血糖为主，伴有眼、肾、心脏、血管、神经系统的慢性损害等并发症为特征的内分泌代谢性疾病[1]。近30年来，我国糖尿病发病率剧增，由1980年的1.0%到2010年的11.6%，患病人数超过1.5亿[2]。Yang等研究表明我国糖尿病早期表现出更严重的胰岛β细胞功能障碍，治疗的关键是维持胰岛β细胞功能和控制餐后血糖浓度[3]。α-葡萄糖苷酶抑制剂可以竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的活性，从而减缓淀粉和蔗糖等向葡萄糖的转化，进而控制餐后血糖的水平[4]。此外，氧化应激与糖尿病及其并发症存在密切相关，应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤，从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生、发展[5]。因此，开发具有清除自由基和控制餐后血糖的功能保健食品对我国II型糖尿病的防治具有重要的意义。

山楂（Crataegus pinnatifida）为蔷薇科山楂属落叶乔木，其果与叶皆可入药[6-7]，具有悠久的药用和食用历史。叶希韵等[8]研究表明，山楂叶黄酮对防治小鼠糖尿病及其并发症有积极的作用。准噶尔山楂（Crataegus songorica）生于河谷或峡谷灌木丛中，分布于俄罗斯、伊朗等地，在中国仅分布于新疆伊犁地区[9]。目前，对准噶尔山楂叶提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究鲜有报道。本文采用体外模型对准噶尔山楂叶不同提取物进行抗氧化和降血糖活性初筛，以期发现基于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降血糖活性成分，初步探索提取物总黄酮含量与活性之间的相关性，为准噶尔山楂资源的利用与开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

准噶尔山楂叶分别于7、8、9、10月采于新疆伊犁霍城县大西沟，经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉副教授鉴定为蔷薇科准噶尔山楂叶，洗净，晾干后60℃烘干至恒重，粉碎过60目筛备用，树叶标本存放于伊犁师范学院资源与生态研究所。

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、氯化铝：购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH：长城生物化学工程有限公司；芦丁标准品：购自中国食品药品检定研究院（批号100080-201408）；α-葡萄糖苷酶（Yeast，EC 3.2.1.20）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖：购自阿拉丁试剂公司（上海）。

SpectraMax M2多功能读板机：Molecular Devices，USA；UV-2550紫外可见分光光度计：日本岛津分析仪器厂；XH-2008D智能温控低温超声波催化合成仪：北京祥鹄科技发展有限公司；DD-5M型低速离心机：湘仪离心机有限公司；FA2104电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；BAO-150AG型电热恒温干燥箱：上海亚荣生化仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 准噶尔山楂叶提取物制备

[10]的方法，精密称取6.000 0 g备用准噶尔山楂叶（采于7、8、9、10月），分别装入可密闭的三颈烧瓶内，按料液比1∶30（g/mL）加入60%乙醇溶液，在300W功率下，保持70℃超声提取30min，提取2次，合并提取液，4 000 r/min离心10min，取上清液减压浓缩干燥后得7月提取物（JulE）1.021 5 g、8月提取物（Aug E）0.947 2 g、9月提取物（Sep E）1.154 6 g、10月提取物（OctE）0.830 4 g。

根据测定结果，选取总黄酮含量最高的山楂叶进行分级萃取。精密称取6.000 0 g样品按照上述方法超声提取，合并离心后上清液减压浓缩至无醇味，加水定容至合适体积，依次用等体积的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，萃取余下的水溶液为水部分，回收溶剂后得环己烷部分（Cy E）0.073 6 g、乙酸乙酯部分（EA E）0.238 5 g、正丁醇部分（Bu E）0.322 1 g和水部分（W tE）0.232 7 g。

1.2.2 总黄酮含量测定

为避免含邻二酚类化合物对总黄酮含量测定的干扰，参考文献[11]的方法，采用AlCl3法分别测定准噶尔山楂叶不同提取物总黄酮含量。精密移取备用芦丁标准溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，分别加入盛有5.0mL 60%乙醇溶液的25mL相同规格的容量瓶中，再加2.0mL 0.1mol/L氯化铝溶液和1.0mL醋酸-醋酸钠缓冲液（pH=5.5），60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15min，于417 nm处测定吸光值。以芦丁标准溶液质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线得y=27.462 x+0.000 6，R2=0.995 9，结果表明在浓度0.02mg/mL至0.06mg/mL范围内两变量呈现良好的线性关系。准确吸取1.0mL配制的提取液，分别按照上述方法测定吸光度，并根据公式（1）计算总黄酮含量。

式中：Y为总黄酮含量，mg/g；k待测液与测试液体积之比；c为标准曲线法计算所得浓度，mg/mL；V为测试液定容的体积，mL；m为称取准噶尔山楂叶质量，g。

1.2.3 清除DPPH自由基试验

参照文献方法[12]并稍加修改：配制准噶尔山楂叶提取物、萃取液、BHA待测液，逐级稀释使用。将各供试样品溶液分别移取20μL于10mL比色管中，另取0.6mmol/L的DPPH溶液1.0mL加入各比色管中，用无水乙醇定容至10mL，摇匀，在避光条件下静置30 min后，于517 nm波长处测定吸光值，考虑山楂叶提取物自身吸光值的影响，配制未加DPPH溶液的对照组扣除其吸光值，每组样品进行3次平行试验。DPPH·清除率按公式（2）计算：

式中：A0为DPPH溶液定容后的吸光度；A1为不同浓度的样品溶液添加DPPH溶液定容后的吸光度；A2为不同浓度的样品溶液定容后的吸光度。

1.2.4 还原能力测定

参照文献方法[12]并稍加修改：分别量取系列浓度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mg/mL）的各提取物、萃取液、BHA 2.5mL于10mL比色皿中，分别加入2.5mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH=6.6）和2.5 mL铁氰化钾（1%）。将混合物放置到50℃的水浴中保温20min后，加2.5mL三氯乙酸，3 000 r/min离心10min，取2.5mL上清液分别加入2.0mL蒸馏水和0.5 mL氯化铁溶液（0.1%），以乙醇溶液做空白试验，测定混合物在700 nm处的吸光度，每组样品进行3次平行试验。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

参照文献[13]的方法稍作修改，96孔板中分别加入50μL不同浓度的溶于甲醇和0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.8，精确称取8.66 g K2HPO4和6.85 g KH2PO4溶解于超纯水中，并定容至1 L）的被测试样品，50μL磷酸盐缓冲液和40μL 0.25 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，每个样品设3个复孔，37℃恒温孵育10 min后加入40μL 5mmol/L pNPG溶液，立即于405 nm波长下测定其OD值（S0min），反应5min后相同波长条件下测定其OD值（S5min），加入相同体积的甲醇磷酸盐缓冲液作为空白对照，阿卡波糖为阳性对照。按照公式（3）计算抑制率：

式中：C0为加入缓冲液代替样品的空白对照0 min时的OD值；C5空白对照5min时的OD值；S0为加入测试样品0min时的OD值；S5为加入测试样品5min时的OD值。

1.2.6 数据分析

采用Excel2003进行数据分析并计算抑制率、清除率，根据抑制率和浓度采用FORECAST函数计算IC50。

2 结果与分析

2.1 准噶尔山楂叶不同提取物总黄酮含量测定结果准噶尔山楂叶不同提取物总黄酮含量见图1。

图1 准噶尔山楂叶不同提取物总黄酮含量Fig.1 Total flavonoids of different extracts of Crataegus songorica leaves

药理学研究表明，山楂叶对心脑血管和消化系统具有重要的药用价值，其主要活性成分为黄酮类化合物。因此试验对准噶尔山楂叶不同提取物中总黄酮含量进行测定。由图1可知，7月到10月期间采摘准噶尔山楂叶所含总黄酮没有显著性差异，其中8月份采摘样品总黄酮含量最高，为14.97mg/g。有文献[14]报道光照能够强烈的影响植物的初生代谢、植物细胞生长及次生代谢产物积累。推测原因新疆伊犁地区8月日照时间最长，紫外线辐射强度大，影响了准噶尔山楂正常的生理活动，促使其局部组织或器官合成较多的黄酮类化合物，以利于自身的保护。对8月采集样品进行分级萃取，所得样品中EAE总黄酮含量最高，为28.87mg/g，Bu E总黄酮含量次之，提示准噶尔山楂叶萃取物中富含中等极性黄酮类化合物。Cy E和WtE总黄酮含量较少，各萃取相总黄酮含量存在显著性差异。

2.2 准噶尔山楂叶不同提取物清除DPPH自由基活性

准噶尔山楂叶不同提取物清除DPPH自由基活性见图2。

在多种快速评估抗氧化活性的方法中，清除DPPH自由基模型与其它方法相比更为广泛使用。由图2可知，在测试质量浓度内，各提取物活性呈现出浓度依赖性，且清除DPPH自由基活性差异显著。其活性顺序为EA E>Bu E>Aug E>Jul E>Oct E>Sep E>BHA> Cy E>WtE。其中EA E（IC50=0.026mg/mL）和Bu E（IC50=0.084mg/mL）对DPPH自由基清除活性较强，远高于阳性对照BHA（IC50=0.996mg/mL），而Cy E和WtE清除能力相对较弱。结合图1可知，总黄酮含量较高的EA E和Bu E比其它提取物清除DPPH自由基的能力强，不同月份提取物的清除能力与其总黄酮含量存在一定的正相关性。

2.3 准噶尔山楂叶不同提取物还原能力

准噶尔山楂叶不同提取物还原能力见图3。

大多数化合物的还原能力可以看作是其潜在抗氧化活性的重要指标。由图3可知，在测定质量浓度范围内，除Cy E和WtE外，其余各提取物还原能力均强于对照BHA。其中EA E和Bu E表现出较强的还原能力，显著高于其它提取物。不同月份提取物表现出与BHA相近的还原能力，且还原能力随着浓度的增大而不断增大，量效关系较为明显。

2.4 准噶尔山楂叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性

准噶尔山楂叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性见表1。

图2 准噶尔山楂叶不同提取物清除DPPH自由基活性Fig.2 DPPH scavenging activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

图3 准噶尔山楂叶不同提取物还原能力Fig.3 Reducing power of different extracts of Crataegus songorica leaves

表1 准噶尔山楂叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性Table1 α-glucosidase inhibitory activity of different extracts of Crataegus songorica leaves

由表1可知，在同一浓度下，准噶尔山楂叶不同月份提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性顺序为：Aug E> Sep E>Jul E>Oct E，其中Aug E（IC50=478.72μg/mL），活性高于阳性对照阿卡波糖（IC50=1 044.32μg/mL）。对8月份山楂叶分级萃取物进行活性测定，其中Cy E和WtE活性较弱，未能计算其IC50值。EA E（IC50= 191.71μg/mL）和Bu E（IC50=305.22μg/mL）对α-葡萄糖苷酶抑制活性远高于阳性对照阿卡波糖，表明EA E和Bu E富集了抑制α-葡萄糖苷酶的有效成分。结合图1可知，总黄酮含量较高的EA E、Bu E和Aug E表现出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

2.5 各提取物质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

准噶尔山楂叶不同提取物质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响见图4。

图4 准噶尔山楂叶不同提取物质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响Fig.4 Effects of concentration of different extracts from Crataegus songorica leaves on α-glucosidase inhibitory activity

由图4可知，当供试质量浓度小于1 000μg/mL时，各提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈现明显的量效关系，即抑制率随着质量浓度升高而逐渐增大，其中活性较好为总黄酮含量较高的EA E、Bu E和 Aug E。在质量浓度为1 000μg/mL时，三者对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为70.52%、96.70%、85.57%，远高于阿卡波糖活性（47.85%），此后三者抑制率随着浓度增大变化不显著。其余各提取物在测试浓度范围内表现出与阿卡波糖相近的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3 结论

大量的研究表明自由基与人类一百多种疾病的发生有关[15]。自由基具有很强的氧化能力，适量的自由基通过信息调控维持机体的氧化应激和氧化还原的平衡。糖尿病发生后，人体在高血糖刺激下，产生过量的自由基增加氧化应激，导致细胞的损伤和死亡[16]，促进糖尿病及其并发症的发生、发展。本文对准噶尔山楂叶不同醇提物和萃取物的体外抗氧化活性和降血糖活性进行了比较，结果表明，总黄酮含量较高的EA E、Bu E和Aug E具有强氧化活性的同时也表现出较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而总黄酮含量较低的Cy E和WtE体外降血糖和抗氧化活性均较弱。说明准噶尔山楂叶的主要降血糖成分为黄酮类化合物，这与有关报道一致[17]。其中乙酸乙酯萃取物具有较好的开发天然抗糖尿病药物的潜力，其具体活性成分追踪分离和作用机制有待进一步研究。

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Antioxidant and Alpha-glucosidase Inhibitory Activity of Crataegus songorica Leaves

LIU Wei，REN Yan-li，RANG Feng-ju，HE Xiao-yan，OUYANG Yan*
（University and College Key Lab of Natural Product Chemistry and Application in Xinjiang，Yili Normal University，Yining 835000，Xinjiang，China）

Crataegus songorica leaves collected in different months were extracted by ethanol then partitioned by system solvents with different polarity.The total flavonoids in the ethanol extract，cyclohexane fraction，ethyl acetate fraction，n-butanol fraction and water fraction were measured and the antioxidant activity and in vitro hypoglycemia activity were assayed by scavenging activity of DPPH radicals，reducing power and anti-α-glucosidase activity.The results showed that different extracts from Crataegus songorica leaves all exhibited different degree of antioxidant activity and anti-α-glucosidase activity，among which ethyl acetate fraction showed strong activity.The ethyl acetate fraction had 28.87mg/g of total flavonoids and its IC50of DPPH assay was 0.026mg/mL while the IC50of anti-α-glucosidase activity was 191.71 g/mL，it was far higher than that of the positive control BHA（IC50=0.996mg/mL）and acarbose（IC50=1 044.32 g/mL）.The antioxidant and antiα-glucosidase activities of the extracts were positively correlated to their total flavonoids，it showed that flavonoids were main factors for the activities.

Crataegus songorica leaves；total flavonoids；anti-oxidantion；anti-α-glucosidase activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.005

2016-05-14

伊犁师范学院重点科研计划项目（2015YSZD02）

刘伟（1985—），男（汉），实验师，硕士，主要从事天然产物活性成分研究。

*通信作者：欧阳艳（1965—），女（汉），教授，博士，主要从事天然产物活性成分研究。