黑果腺肋花楸黄酮提取工艺优化及体外抗氧化研究

刘静，徐莉莉

（内蒙古商贸职业学院食品工程系，内蒙古呼和浩特010070）

黑果腺肋花楸黄酮提取工艺优化及体外抗氧化研究

刘静，徐莉莉

（内蒙古商贸职业学院食品工程系，内蒙古呼和浩特010070）

应用黑果腺肋花楸作为原料，采用响应面法优化黑果腺肋花楸黄酮提取工艺，并利用VC做对照试验，对其还原力及以及·OH、O2-·、DPPH自由基清除力进行研究。结果表明，最佳工艺参数为乙醇浓度77.67%、提取时间81min、料液比1∶20（g/mL），在此条件下，黑果腺肋花楸黄酮得率5.14%。影响黑果腺肋花楸黄酮得率因素由大到小依次为乙醇浓度>提取时间>料液比。最佳工艺参数提取的黑果腺肋花楸黄酮对·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分别为3.27、3.96、3.79mg/mL，最大清除率达29.58%、70.23%、61.41%，并且其还原能力强，能够说明其体外抗氧化活性较强。

黑果腺肋花楸；黄酮；响应面；抗氧化

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）营养丰富，富含多种蛋白质、碳水化合物维生素等成分[1-2]；还含有一些功能性成分，均对人体有积极作用，如花色苷、多糖、黄酮、多酚类化合物[3-4]，具有消炎、降血脂、抗疲劳、降血压等功效，还具有清除机体自由基的作用[5-6]。目前研究黑果腺肋花楸酿酒等方面较多，其功能性成分的研究并不多见，尤其在我国，功能性产品仍处于发展阶段，保健类产品较少[7-8]。本研究采用对黑果腺肋花楸黄酮进行提取，并研究其体外抗氧化活性以及对自由基的清除作用，旨在为开发黑果腺肋花楸功能性开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸：陕西藤迈生物科技有限公司；Al（NO3）3、NaOH、无水乙醇、NaNO2、VC、三氯化铁、DPPH、芦丁标准品等均为国产分析纯：北京化工厂。

1.2 仪器与设备

ohaus CP214型电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限公司；PF-40B型离心机：湖南长沙平凡仪器仪表有限公司；美国VortexGenie2T旋涡混合器：美国Scientific Industries公司；7230G扫描型可见分光光度计：上海棱光技术有限公司；HH-6型数显水浴锅：南京科尔仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸黄酮提取工艺流程

黑果腺肋花楸→淋洗→沥水→烘干→粉碎→过筛（120目）→乙醇提取→分离→过滤→滤液浓缩→冻干→黄酮

1.3.2 黑果腺肋花楸黄酮提取单因素试验

1.3.2.1 乙醇浓度对黄酮得率的影响

在提取时间80min、料液比1∶20（g/mL）时，乙醇浓度分别为65%、70%、75%、80%、85%时，以黑果腺肋花楸黄酮得率为评价指标，研究乙醇浓度对黄酮得率的影响。

1.3.2.2 提取时间对黄酮得率的影响

在料液比1∶20（g/mL）、乙醇浓度75%时，提取时间分别为70、75、80、85、90min时，以黑果腺肋花楸黄酮得率为评价指标，研究提取时间对黄酮得率的影响。

1.3.2.3 料液比对黄酮得率的影响

在提取时间80min、乙醇浓度75%时，料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）时，以黑果腺肋花楸黄酮得率为评价指标，研究料液比对黄酮得率的影响。

1.3.3 黑果腺肋花楸黄酮提取工艺优化

根据单因素结果，以乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）做因素，以黄酮得率（Y）为指标，设计响应面试验，确定黄酮提取最佳工艺参数。试验设计因素水平见表1。

表1 因素与水平Table1 Factors and levels

1.3.4 芦丁标准曲线的绘制[9-11]

取芦丁标准品1 g，向其中加入无水乙醇（30%）至100mL；从容量瓶中取出5mL，再定容至100mL，可得到0.5mg/mL芦丁标准溶液；从中分别取出0、1、2、3、4、5、6mL溶液于25mL比色管内，向比色管中加入无水乙醇（30%）至10mL，再加浓度5%的NaNO20.8mL，混合均匀，静止5min，再加浓度10%的Al（NO3）30.8 mL，混匀后静止5min，继续加NaOH溶液（4%）5mL，继续向其中加入无水乙醇（40%）至25mL，混匀后静置20min，分别取液体于510nm波长处测定吸光度，同时用蒸馏水做对照。以芦丁质量浓度为X轴、吸光值为Y轴，得回归方程：Y=0.412X＋0.003，R2=0.9997。

1.3.5 黄酮得率的测定

精确称取10mL方法1.3.1节中浓缩滤液，加入比色管中进行定容，再按照1.3.4中的方法试验，测定吸光值，根据回归方程可计算出黄酮含量[12-13]。再根据公式（1）进行计算黑果腺肋花楸黄酮的得率：

1.3.6 黑果腺肋花楸黄酮体外抗氧化活性试验

利用最佳工艺参数制取的黄酮为研究对象，研究其体外抗氧化活性。测定还原力参照铁氰化钾还原法；测定·OH清除率采用邻二氮菲法；测定DPPH自由基清除率参照DPPH法；测定O2-·清除率采用邻苯三酚自氧化法[14-15]。

1.3.7 半抑制浓度（half maximal（50%）inhibitoryconcentration，IC50）的计算

以黑果腺肋花楸黄酮质量浓度做横坐标，以黄酮及VC对·OH、DPPH自由基、O2-·的清除率为纵坐标，做出线性曲线，当清除率为50%时黑果腺肋花楸黄酮的质量浓度即IC50；以IC50值作为评价黑果腺肋花楸黄酮的抗氧化能力指标[16]。

2 结果

2.1 黑果腺肋花楸黄酮提取单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响

乙醇浓度对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响见图1。

图1 乙醇浓度对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根据图1，当乙醇浓度为65%时，黄酮得率最低，当乙醇浓度升高后，黑果腺肋花楸黄酮得率逐渐升高，当乙醇浓度达到75%时，黑果腺肋花楸黄酮得率最高，为4.52%。继续增大乙醇浓度后，黑果腺肋花楸黄酮得率几乎不变，原因可能是黑果腺肋花楸黄酮已经被完全提出，故继续提高乙醇浓度没有效果。

2.1.2 提取时间对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响

提取时间对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响见图2。

图2 提取时间对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根据图2，当提取时间为70min时，黄酮得率最低，当提取时间增加后，黄酮得率逐渐升高，当提取时间为80 min时，黑果腺肋花楸黄酮得率最高，为4.50%。继续延长提取时间后，黑果腺肋花楸黄酮得率几乎不变，原因可能是黑果腺肋花楸黄酮已经被完全提出，故继续延长时间对黑果腺肋花楸黄酮得率无影响。

2.1.3 料液比对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响

料液比对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响见图3。

图3 料液比对黑果腺肋花楸黄酮得率的影响Fig.3 Effect of liquid ratio on the yield of black fruit Aronia flavonoids

根据图3，当料液比为1∶10（g/mL）时，黑果腺肋花楸黄酮得率最低，随着料液比的变大，黑果腺肋花楸黄酮得率先升高后降低，当料液比为1∶20（g/mL）时黄酮得率最高，原因可能是，乙醇浓度较小时，不能够使得黑果腺肋花楸黄酮完全被提出，当液体较多时，黄酮得率较低。

2.2 黑果腺肋花楸黄酮提取工艺参数的优化

2.2.1 数学模型的建立与显著性检验

由单因素结果，利用软件进一步优化工艺参数。考察乙醇浓度（A）、提取时间（B）、料液比（C）对黑果腺肋花楸黄酮得率（Y）的影响，试验设计方案及结果见表2。

采用Design-Expert8.0.6软件对表2数据进行统计分析、方差分析及显著性检验，得到以黄酮得率为目标函数，关于各因素编码值的二次回归方程为：Y= 4.89＋0.98A＋0.71B＋0.23C＋0.55AB＋0.065AC－0.37BC－1.48A2－1.17B2－0.78C2。对数据进行显著性检验，方差结果见表3，可信度结果见表4。

表2 Box-Benhnken的中心组合试验设计及结果Table2 Box-Benhnken the central composite experimental design and results

根据表4、5，此模型P值远小于0.01，故此模型极显著，误差很小，故能够用此模型代替真实值对黑果腺肋花楸黄酮得率做出分析，R2=98.62%，此模型可靠性高。在回归模型中，一次项A、B，交互项AB，二次项A2、B2、C2，均极显著，一次项C，交互项BC，均显著。方差分析表明，影响黑果腺肋花楸黄酮得率因素由大到小依次为乙醇浓度＞提取时间＞料液比。

表3 回归方程方差分析表Table3 Analysis of variance table for regression model

表4 回归模型的可信度分析Table4 Reliability analysis of the established regression model

2.2.2 因素间相互作用响应面分析结果

因素间相互作用响应面分析结果见图4。

图4 响应面及等高线图Fig.4 Response surfaces and contour plots

响应面图能够说明各个因素间的相互关系。通过响应面软件对相关数据进行分析，能够得到立体图。等高线也可直观反映两因素关系[17-18]。等高线中椭圆形表示两因素之间影响极显著，圆形表示因素间影响不显著。乙醇浓度（A）与提取时间（B）为椭圆形，影响极显著，提取时间（B）与料液比（C）为椭圆形，影响显著，而乙醇浓度（A）与料液比（C）为圆形，影响不显著。

2.2.3 优化黑果腺肋花楸黄酮提取工艺参数

为确定最佳参数，对拟合的回归方程求分别一阶偏导数，并设其为0，得到三元一次方程组如下：

求解得：A＝0.533、B＝0.200、C＝0，即最佳条件为乙醇浓度为77.67%、提取时间为81 min、料液比为1∶20（g/mL），在此条件下黑果腺肋花楸黄酮得率为5.14%。

2.3 黑果腺肋花楸黄酮的体外抗氧化活性

黑果腺肋花楸黄酮的体外抗氧化活性见图5。

图5 黑果腺肋花楸黄酮的还原力及·OH、O2-·、DPPH自由基清除率Fig.5 Reducing power and hydroxyl，superoxide anion and DPPH radical scavenging activities of black fruit Aronia flavonoids

根据图5能够看出，在所试验的浓度范围内，黑果腺肋花楸黄酮和VC的还原力均随着浓度的增大而增大，线性关系较好，其中4.1mg/mL的黑果腺肋花楸黄酮的还原能力与250μg/mL的VC几乎一致。黑果腺肋花楸黄酮对·OH、O2-·、DPPH自由基均能够起到清除作用，剂量效果明显，当黑果腺肋花楸黄酮质量浓度为5.14mg/mL时，其自由基最大清除率可分别为2 9.58%、70.23%、61.41%，抗氧化活性较好。对黑果腺肋花楸黄酮的·OH、O2-·、DPPH自由基清除率与质量浓度做线性回归分析，其线性回归方程分别是：Y（·OH）= 0.0998X－0.0301，R2=0.9976；Y（O2-·）=0.183 2X－0.022 3，R2=0.998 6；Y（DPPH·）=0.160 4X＋0.006，R2=0.999 7，线性关系很好且剂量关系明显；由此能够计算出黑果腺肋花楸黄酮的·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分别为3.27、3.96、3.79mg/mL。

3 结论

本试验采用响应面法优化黑果腺肋花楸黄酮提取工艺，并研究其体外抗氧化活性。最佳参数为乙醇浓度77.67%、提取时间81min、料液比1∶20（g/mL），在此条件下，黑果腺肋花楸黄酮得率为5.14%。方差分析表明，影响黑果腺肋花楸黄酮得率因素由大到小依次为乙醇浓度>提取时间>料液比。制得的黑果腺肋花楸黄酮对·OH、O2-·、DPPH自由基的IC50分别为3.27、3.96、3.79mg/mL，最大清除率分别达29.58%、70.23%、61.41%，且表现出很强的还原能力，说明其体外抗氧化活性较强。

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Study on Black Fruit Aronia Flavonoids Extraction Process and Its Antioxidant Activity

LIU Jing，XU Li-li
（Department of Food Engineering，Inner Mongolia Business&Trade Vocational College，Huhhot 010070，Inner Mongolia，China）

Black fruit Aronia as raw material，single factor and response surface analysis black fruit Aronia the extraction process，and VCas control its antioxidant capacity and 1，1-diphenyl-2 trinitrobenzene hydrazine radical（DPPH·），superoxide anion radical（O2-·），hydroxyl radical（·OH）scavenging were studied.The resultsshowed that the optimum parameters for the ethanol concentration77.67%，extraction time81min，1∶20（g/mL），in this condition，black fruit Aronia flavonoids yield an average of 5.14%.Effect of black fruit Aronia yield of flavonoids descending factor ethanol concentration>extraction time>solid-liquid ratio.The optimal parameters extracted black fruit Aronia flavonoids on·OH，O2-·，DPPH radical IC50were 3.27，3.96，3.79mg/mL，the maximum clearance rate of29.58%，70.23%，61.41%and showed a strong reducing power，has strong antioxidant activity in vitro.

black fruit Aronia；flavonoids；response surface；antioxidant

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.014

2016-09-04

内蒙古商贸职业学院项目（NSZY1103）

刘静（1972—），女（汉），副教授，硕士，研究方向：食品营养与加工。