双波长HPLC法同时测定两面针药材中5种成分的含量Δ

孙 科，陈 冉，陆世惠（1.右江民族医学院生化教研室，广西百色 533000；.右江民族医学院科学实验中心，广西百色 533000；3.右江民族医学院药学院，广西百色 533000）

双波长HPLC法同时测定两面针药材中5种成分的含量Δ

孙 科1＊，陈 冉2，陆世惠3#（1.右江民族医学院生化教研室，广西百色 533000；2.右江民族医学院科学实验中心，广西百色 533000；3.右江民族医学院药学院，广西百色 533000）

目的：建立同时测定两面针药材中5种成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Luna C18，流动相为乙腈-水（含0.2%磷酸、0.25%三乙胺）（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为273、284 nm，柱温为30℃，进样量为20 μL。结果：别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素检测质量浓度线性范围分别为0.8～200、0.2～50、0.44～110、0.208～52、0.944～236 μg/mL（r均为0.999 9）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2.0%；加样回收率分别为101.47%～103.92%（RSD＝0.92%，n＝9）、102.52%～104.68%（RSD＝0.63%，n＝9）、97.55%～101.22%（RSD＝1.09%，n＝9）、103.35%～104.93%（RSD＝0.71%，n＝9）、99.31%～103.86%（RSD＝1.34%，n＝9）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于两面针药材中5种成分含量的同时测定。

高效液相色谱法；两面针；别隐品碱；盐酸血根碱；氯化两面针碱；白屈菜红碱；芝麻素；含量

两面针Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC.，为芸香科花椒属植物，根部入药，主要分布在我国南方等地[1]，主治风湿骨痛、跌打损伤、牙痛、毒蛇咬伤等症。两面针中富含多种抗肿瘤的活性成分，如别隐品碱、盐酸血根碱[2]、氯化两面针碱、白屈菜红碱[3]、芝麻素[4]等，上述成分还具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛活性[5-9]。目前关于两面针中活性成分的测定局限于主要成分，如氯化两面针碱、白屈菜红碱[10-11]，目标组分单一，不能全面反映两面针药材的质量。本试验旨在建立一种高效、快速的高效液相色谱法（HPLC）同时测定两面针中别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素多种组分的含量，为完善该药材的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

U3000型HPLC仪，包括PDA二极管阵列检测器（美国Dionex公司）；KQ-250DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz）；FA2004N型电子分析天平（上海民析精密科学仪器公司）；101-3型电热鼓风干燥箱（上海齐欣科学仪器公司）。

1.2 试剂

别隐品碱对照品（北京盛世康谱化工技术研究院，批号：B-059-140727）、盐酸血根碱对照品（批号：510001-201101）、氯化两面针碱对照品（批号：110848-200603）、白屈菜红碱对照品（批号：111718-201402）、芝麻素对照品（批号：110386-201005）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；乙腈为色谱纯，乙醇、甲醇、磷酸、三乙胺为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

两面针药材（产地：广西）经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（含0.2%磷酸和0.25%三乙胺，B），梯度洗脱（0～6 min，25%A；6～25 min，25%→32%A；25～29 min，32%→60%A；29～42 min，60%A）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：273、284 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取待测成分对照品适量，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素质量浓度分别为1.00、0.25、1.10、0.52、1.18 mg/mL的单一对照品贮备液。分别量取上述单一对照品贮备液各适量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，摇匀，制成别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素质量浓度分别为200、50、110、52、236 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取样品粉末（粒径≤0.5 mm）适量，精密称定20.0 g，加60%乙醇超声提取20 min，重复提取3次（料液比均为1∶6），合并提取液，加乙醇定容至360 mL，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液，即得。

2.3 系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。结果表明，理论板数以别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素峰计分别为9 824、16 113、30 250、37 974、188 114；分离度均＞1.5，各成分基线分离良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.02、0.25、1.0、2.0、4.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合对照品溶液。精密量取上述系列混合对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素回归方程分别为y＝0.191x—0.412（r＝0.999 9）、y＝1.697x—0.704（r＝0.999 9）、y＝1.860x—0.947（r＝0.999 9）、y＝1.629x+0.751（r＝0.999 9）、y＝0.498x—0.644（r＝0.999 9）。结果表明，别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素检测质量浓度线性范围分别为0.8～200、0.2～50、0.44～110、0.208～52、0.944～236 μg/mL。

2.5 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素峰面积的RSD分别为0.45%、0.37%、0.25%、0.64%、0.58%（n＝6），表明仪器精密度良好。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、4、8、10、12、24、48、96 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素峰面积的RSD分别为0.41%、0.39%、0.28%、0.59%、0.67%（n＝8），表明供试品溶液在室温放置96 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果，别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素平均含量分别为0.544、0.078、0.982、0.234、0.055 mg/g，RSD分别为0.91%、0.78%、0.90%、0.37%、1.06%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品适量，共6份，分别加入低、中、高质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表1。

2.9 样品含量测定

取样品适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表2。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3 讨论

3.1 检测波长的选择

利用PAD二极管阵列检测器对5种待测成分对照品进行三维图谱分析，结果显示别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素的最大吸收波长分别在284、273、273、268、284 nm处，其中，白屈菜红碱在268和273 nm波长处的吸收值相近、其余4种组分在284和273 nm波长处的吸收值相差较大，为提高检测灵敏度，采用双波长同时测定的模式进行测定。选择在284 nm波长处检测别隐品碱、芝麻素，273 nm波长处检测盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱。

表2 样品含量测定结果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.2 流动相的选择

色谱柱固定相硅胶表面的硅羟基（SiOH）pKa值为2～3，当流动相的pH＞3时，部分SiOH电离以SiO-形式存在，会与待分析的碱性生物碱发生很强的吸附作用，造成生物碱的色谱峰展宽、拖尾、保留时间漂移、分离效果不佳。改性剂三乙胺因与SiO-具有更强作用力，可以显著降低待分析生物碱的吸附作用，且对色谱柱损伤小，因此是作为色谱峰拖尾抑制剂的较佳选择[12]。本试验选择在流动相中加入一定量的三乙胺，通过加磷酸调节pH，结果各组分的保留时间随pH的升高而增加，且峰展宽，峰型变差，因此选择低pH的缓冲液，但C18难以承受pH＜2的酸度。综合考虑，最终选择以乙腈-0.2%磷酸-0.25%三乙胺（pH 2.5）为流动相进行分析测定，样品中待测组分峰形好，且总体保留时间适中。

3.3 样品处理方法的优化

笔者考察了不同溶剂（40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇、乙醇-丙酮、丙酮、乙酸乙酯、乙酸乙酯-正丁醇、正丁醇）对提取效率的影响。结果显示，别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱在60%和80%甲醇中提取率较高，这是由于这4种生物碱的极性较强，用强极性溶剂更易于提取，但有机溶剂含量太低，又不利于其溶解，因此用40%乙醇提取效果较差。最终采用60%乙醇作为提取溶剂。

本试验通过HPLC-PAD方法，首次完成两面针药材中别隐品碱、盐酸血根碱、氯化两面针碱、白屈菜红碱、芝麻素5种成分含量的同时测定，该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可为两面针药材的开发利用提供一定参考。

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Simultaneous Determination of 5 Components in Zanthoxylum nitidum by Dual-wavelength HPLC

SUN Ke1，CHEN Ran2，LU Shihui3（1.Dept.of Biochemistry，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；2.Science Experiment Center，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China；3.School of Pharmacy，Youjiang Medical University for Nationalities，Guangxi Baise 533000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 5 components in Zanthoxylum nitidum. METHODS：HPLC was performed on the column of Luna C18with mobile phase of acetonitrile-water（containing 0.2%phosphoric acid，0.25%triethylamine）（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 273，284 nm，column tem-perature was 30℃，and the injection volume was 20 μL.RESULTS：The linear range was 0.8-200 μg/mL for allocryptopine（r＝0.999 9），0.2-50 μg/mL for sargentine hydrochloride（r＝0.999 9），0.44-110 μg/mL for nitidine chloride（r＝0.999 9），0.208-52 μg/mL for toddaline（r＝0.999 9）and 0.944-236 μg/mL for sesamin（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%；recoveries were 101.47%-103.92%（RSD＝0.92%，n＝9），102.52%-104.68%（RSD＝0.63%，n＝9），97.55%-101.22%（RSD＝1.09%，n＝9），103.35%-104.93%（RSD＝0.71%，n＝9），99.31%-103.86%（RSD＝1.34%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibility，and can be used for the simultaneous determination of 5 components in Z.nitidum.

HPLC；Zanthoxylum nitidum；Allocryptopine；Sargentine hydrochloride；Nitidine chloride；Toddaline；Sesamin；Content

R284.1；R917

A

1001-0408（2017）03-0393-04

2016-02-21

2016-05-09）

（编辑：张 静）

广西自然科学基金资助项目（No.2014GXNSFBA118185）

＊助理实验师，硕士研究生。研究方向：药物分析。E-mail：1571474488@qq.com

#通信作者：高级实验师，博士研究生。研究方向：天然产物的提取分离鉴定及其生物活性。E-mail：lushihui0818@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.30