鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

，，，，，，，，

（1. 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045；2. 深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）

鲤春病毒血症病毒核酸适配体的筛选及分析

于 力1，王津津1，卢奕良2，郑晓聪1，贾 鹏1，何俊强1，史秀杰1，刘 莹1，刘 荭1

（1. 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045；2. 深圳大学生命与海洋科学学院，广东深圳 518060）

核酸适配体（Aptamer）是一类单链短DNA或RNA片段，具有一定的空间结构，对特定靶分子具有亲和力。本研究采用指数富集配体系统进化技术（SELEX），首次筛选出针对鲤春病毒血症病毒（SVCV）的核酸适配体A2和A15，经过荧光PCR、凝胶阻滞和病毒中和实验，证明了其对SVCV具有结合力和抑制作用，在该病的检测和防治方面具有良好的前景。

核酸适配体；指数富集配体系统进化技术；鲤春病毒血症病毒；病毒抑制

核酸适配体（Aptamer）又称为核酸适配子，是一类单链短DNA或RNA片段，具有一定的空间结构，对特定的靶分子具有亲和力[1-4]。核酸适配体一般通过对核酸适配体库进行体外筛选获得，这种技术名为指数富集配体系统进化技术（Selective expansion of ligands by exponential enrichment，SELEX）[1-2]。适配体库长度一般为50～100 nt，两端为固定序列，能与特定引物结合，中间为20～50 nt的随机序列，因此理论上存在420～450种序列，以及多种二级结构。适配体库通过与靶分子结合、洗脱、PCR富集等步骤的循环，可达到迅速富集具有亲和力适配体的效果，目前主要运用于医学前沿领域，如抑制人兽共患病毒[5-6]，以及抗肿瘤药物的研发[7]等。

鲤春病毒血症（Spring viremia of carp）是世界动物卫生组织（OIE）须通报动物疫病，致死率高，宿主主要为鲤科鱼类，对我国鲤科鱼养殖业造成很大威胁。其病原为鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of carp virus，SVCV），属于弹状病毒科。SVCV病毒粒子呈子弹状，长90～180 nm，宽60～90 nm，基因组长度为11 019 nt[8-9]。

核酸适配体属于比较前沿的技术，目前主要运用于医学领域，而运用于水生动物病毒的研究较少，尚未有关于SVCV适配体的文章发表。

1 材料和方法

1.1毒株和细胞系

SVCV A-1株[10]由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心分离并保存；鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心保存。

1.2核酸适配体的合成

核酸适配体序列为5'-GGACACTCAAGGTTCATCAG-40（N）-GAGTAGTTCAGGATAGGACG-3'。引物序列为：AF：5'-GGACACTCAAGGTTCATCAG-3'；AR：5'-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3'；AR-P：5'P-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3'（5'端磷酸化修饰）。均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3SVCV的纯化

培养EPC于25 ℃，传代24 h后接种SVCV。当细胞产生90%病变后，冻融3次，12 000 g 4 ℃离心30 min，收集上清病毒悬液，140 000 g 4 ℃超速离心4 h，去上清，将沉淀用少量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。配制30%、45%、60%梯度蔗糖，将PBS病毒重悬液加于30%蔗糖界面上，100 000 g 4 ℃超速离心3 h，收集30%与45%浓度分界处的沉淀，用适量PBS溶解，140 000 g 4 ℃超速离心4 h，去上清，将沉淀用适量PBS重悬。

1.4纯化SVCV量的测定

纯化SVCV的蛋白质含量测定使用改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），病毒滴度TCID50的测定使用Reed-Muench法[11]。

1.5核酸适配体的SELEX筛选

将500 ng纯化的SVCV和EPC细胞碎片分别包被酶标板（Corning），4 ℃过夜后，用PBS与PBST各洗2次。将5 OD（约5.5 nmole）核酸适配体库溶于PBS，95 ℃加热10 min，立即置于冰上10 min。将适配体库加至EPC细胞碎片包被的孔，室温结合1 h进行负筛选，去除与EPC碎片结合的适配体。将上清加至SVCV包被的孔，室温结合1 h。用PBS洗涤5次后，加入蛋白酶K消化，以释放出结合的适配体。对消化液上清，使用核酸回收试剂盒QIAquick Nucleotide Removal Kit（QIAGEN）进行适配体回收。使用AF/AR引物，进行荧光PCR（SYBR Premix Ex TaqⅡ，Takara），同时设置筛选前适配体库的浓度稀释梯度（102～106倍），以测定结合回收率。

1.6核酸适配体的富集

对回收的核酸适配体，使用AF/AR-P引物，进行普通PCR（Ex Taq，Takara），95 ℃ 2 min，15个循环（95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），72 ℃ 3 min。使用Lambda核酸外切酶（New England Biolabs），37 ℃ 30 min，酶切去除磷酸化修饰的反向链，将单链化后的核酸适配体用于下一轮筛选。重复筛选数次，逐步增加洗涤次数，直至回收率不再提高。

1.7核酸适配体的单克隆与测序

对最后一轮结合后回收的核酸适配体，使用AF/AR引物进行普通PCR。将PCR产物连接到pMD18-T载体（Takara）上，转化到感受态大肠杆菌DH5α（Takara），涂布于氨苄青霉素抗性平板。挑取单克隆，按方法1.5进行结合力确认后，送华大基因进行测序。

1.8二级结构分析

根据核酸适配体的测序结果，使用Mfold软件[12]分析其二级结构，选取自由能ΔG最低，即结构最稳定的构象。

1.9结合力分析

根据测序结果，核酸适配体由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。为验证其结合力，使用10 ng合成的核酸适配体，按方法1.5进行结合、洗涤、酶消化和回收，再进行荧光PCR分析，测定回收率。同时设置EPC细胞碎片包被孔作为阴性对照和空白对照。

1.10凝胶阻滞实验

将1 µg合成的核酸适配体95 ℃加热10 min，立即置于冰上10 min。分别与12 µg、2.4 µg、0.48 µg质量梯度的SVCV室温结合1 h，同时设置阴性对照（12 µg、2.4 µg EPC细胞碎片）和空白对照（12 µg BSA）。2%琼脂糖凝胶电泳，核酸染料（SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain，Life Technology）染色，凝胶成像仪拍照。

1.11病毒中和实验

将15 µg核酸适配体95 ℃加热10 min，立即置于冰上10 min。与6.3×103TCID50/mL SVCV室温结合1 h，接种到传代24 h的EPC细胞。同时设置仅加核酸适配体的孔、阳性对照（仅SVCV）和阴性对照（仅PBS），20 ℃培养5天后观察病变。

2 结果

2.1SVCV量的测定

对纯化后的SVCV进行测定。测得蛋白质含量为1.28 mg/mL，滴度为6.3×109TCID50/mL。

2.2核酸适配体的富集

每轮筛选的回收率如图1所示。前4轮回收率增加不明显，从第5轮开始显著增加，至第8轮趋于稳定，因此选取第9轮的筛选产物进行克隆分析。

图1 核酸适配体SELEX筛选每轮的回收率

2.3测序与构象分析

按方法1.7进行结合力确认后，选取结合力最佳的2个克隆进行测序，编号分别为A2和A15，测序结果见表1，其中两端下划线部分为固定序列；二级结构分析结果见图2，均具有多个茎环结构。

表1 核酸适配体的序列

图2 核酸适配体二级结构

2.4结合力验证

对合成的A2和A15适配体进行结合力验证，结果见图3。A2和A15具有相近的结合回收率，分别为1.43×10-3和1.11×10-3，而阴性对照的回收率分别为2.28×10-5和2.96×10-5。

图3 核酸适配体结合力验证、荧光PCR测定结合回收率

2.5凝胶阻滞实验

适配体A2和A15凝胶阻滞实验结果分别见图4-A和图4-B）。适配体与SVCV结合的凝胶孔内（泳道1～2）可见亮带，且随着SVCV量的减少而减弱。而随着SVCV的量继续减少（泳道3），阴性对照（泳道4～5）和空白对照（泳道6）均未见发生阻滞，说明适配体A2和A15能与SVCV特异结合。

2.6病毒中和实验

仅接种SVCV的阳性对照孔（图5E）出现明显CPE。SVCV与适配体A2孵育后再接种，未出现明显CPE（图5A）；与A15孵育的孔出现微弱CPE（图5C）。而仅加入适配体A2和A15的均未见对EPC细胞产生毒性（图5B和5D），说明A2和A15对SVCV具有中和以及抑制作用，而该适配体对细胞均无毒性。

图4 核酸适配体凝胶阻滞实验结果

图5 核酸适配体病毒中和实验结果

3 讨论

核酸适配体由于具有一定的空间构象，因此具有和靶物质结合的能力。本文运用了SELEX筛选方法，首次筛选出针对SVCV的核酸适配体，其具备理想的结合能力。

核酸适配体筛选的重要一步是靶物质的固定化。目前许多文献主要报道了采取标签化磁珠结合表达蛋白的方法[6，13-14]。本文采取了酶标板包被的方法，靶物质是纯化后的全病毒。全病毒相比表达的蛋白，其抗原空间构象更准确，能提高筛选的成功率。而酶标板具有对核酸吸附低、能吸附无标签蛋白，以及便于洗涤的优点[15]。但这也可能导致杂蛋白的吸附，因此每一轮的筛选都会加入负筛选，以保证及时去除非特异性的适配体[16]。

本文采用三种不同原理的实验方法，对筛选出的核酸适配体进行了验证。荧光PCR方法是通过测定回收率来验证其结合力，这与SELEX筛选过程和方法一致，而测定的回收率也与SELEX最后3轮相近，说明核酸适配体的结合能力与预期相符。凝胶阻滞是测试核酸蛋白质相互作用的方法，也有文章报道用于验证适配体结合力[17]。本文的凝胶阻滞测试结果说明，两种核酸适配体均能与SVCV相结合，引起一定量核酸在凝胶孔中阻滞，而且随着SVCV量的梯度减少而减弱，存在一定比例关系。病毒中和实验结果说明，核酸适配体能对SVCV产生抑制，不对正常细胞产生毒性，佐证了适配体能和SVCV相结合，这也与其他研究相符[18-19]。

从荧光PCR和病毒中和实验结果可看出，2种适配体的效果相近，但A2比A15略好。两者的二级结构比较相似，说明两者可能都是针对SVCV同一种蛋白位点。

综上所述，本文采用了荧光定量、凝胶阻滞和病毒中和三种不同原理的实验，结果均证明了筛选出来的2种核酸适配体对SVCV具有结合能力。由于具备针对SVCV的结合和抑制能力，该适配体在该病的检测和防治方面具有良好的前景。

[1]ELLINGTON A D，SZOSTAK J. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands[J]. Nature，1990，346（6287）：818-822.

[2]TUERK C，GOLD L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase[J]. Science，1990，249（4968）：505-510.

[3]SCHNEIDER D J，FEIGON J，HOSTOMSKY Z，et al. High af fi nity ssDNA inhibitors of the reverse transcriptase of type1 human immunodeficiency virus[J]. Biochemistry，1995，34：9599-9610.

[4]CHEN F，HU Y，LI D，et al. CS-SELEX generates highaf fi nity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2[J]. PLoS One，2009，4（12）：e8142.

[5]LIANG H R，HU G Q，ZHANG T，et al. Isolation of ssDNA aptamers that inhibit rabies virus[J]. Int Immunopharmacol，2012，14（3）：341-347.

[6]WOO H M，KIM K S，LEE J M，et al. Single-stranded DNA aptamer that speci fi cally binds to the in fl uenza virus NS1 protein suppresses interferon antagonism[J]. Antiviral Res，2013，100（2）：337-345.

[7]BATES P J，LADER D A，MILLER D M，et al. Discovery and development of the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment for cancer[J]. Exp Mol Pathol，2009，86（3）：151-164.

[8]AHNE W，BJORKLUND H V，ESSBAUER S，et al. Spring viremia of carp（SVC）[J]. Dis Aqut Org， 2002，52：261-272.

[9]付峰，刘荭，黄倢等. 鲤春病毒血症病毒（SVCV）的研究进展[J]. 中国水产科学，2006，13（2）：328-334.

[10]TENG Y，LIU H，LÜ J Q，et al. Characterization of complete genome sequence of the spring viremia of carp virus isolated from common carp（Cyprinus carpio）in China[J]. Arch Virol， 2007，152（8）：1457-1465.

[11]REED L J， MUENCH H. A simple method of estimating fi fty percent endpoints[J]. Am J Hyg，1938，27：493-497.

[12]ZUKER M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction[J]. Nucl. Acids Res，2003，31（13）：3406-3415.

[13]KONG H Y，BYUN J. Nucleic acid aptamers：new methods for selection，stabilization，and application in biomedical science[J]. Biomol Ther，2013，21（6）：423-434.

[14]CHO S J，WOO H M，KIM K S，et al. Novel system for detecting SARS coronavirus nucleocapsid protein using an ssDNA aptamer[J]. J Biosci Bioeng，2011，112（6）：535-540.

[15]彭磊， 张欣， 孟焕新. 人重组S100A8蛋白适配体的筛选和结构分析[J]. 北京大学学报， 2012，44（1）：11-16.

[16]王巍，贾凌云. 适配体筛选方法研究进展[J]. 分析化学，2009，37（3）：454-460.

[17]HWANG S D，MIDORIKAWA N，PUNNARAK P，et al. Inhibition of hirame rhabdovirus growth by RNA aptamers[J]. J Fish Dis，2012，35（12）：927-934.

[18]LI P，ZHOU L，YU Y，et al. Characterization of DNA aptamers generated against the soft-shelled turtle iridovirus with antiviral effects[J]. BMC Vet Res，2015，11：245.

[19]PUNNARAK P，SANTOS M D，HWANG S D，et al. RNA aptamers inhibit the growth of the fish pathogen viral hemorrhagic septicemia virus（VHSV）[J]. Mar Biotechnol，2012，14（6）：752-761.

（责任编辑：朱迪国）

Selection and Analysis on Aptamers against Spring Viremia of Carp Virus

Yu Li1，Wang Jinjin1，Lu Yiliang2，Zheng Xiaocong1，Jia Peng1，He Junqiang1，Shi Xiujie1，Liu Ying1，Liu Hong1
（1. Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045；2. College of Life Science and Oceanography，Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518060）

Aptamer is a kind of single-stranded oligonucleotides（DNA or RNA）with affinity to specific target molecules due to its certain spatial structure. By adopting the technology of selective evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX），aptamers（A2 and A15）against spring viremia of carp virus（SVCV）were screened out for the first time. Real-time PCR，electrophoretic mobility shift assay，and virus neutralization showed that the aptamers could bind to SVCV，showing inhibitory effects to the virus. Therefore these aptamers had broad prospects for detection，prevention and treatment of SVC.

aptamer；SELEX；SVCV；virus inhibition

S851.34

：A

：1005-944X（2017）02-0101-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.029

国家质检总局科技计划项目（2016IK238）；深圳检验检疫局科技计划项目（SZ2014202和SZ2015203）；质检公益性行业科研专项（201210055）

刘 荭