靶向亲和液相色谱质谱联用技术快速筛选黄藤总生物碱中乙酰胆碱酯酶抑制剂

何忠梅　吕娜　南敏伦　赵昱玮　赫玉芳　孟令文　孙佳明　张连学

摘要采用靶向亲和液相色谱质谱联用技术 （Target molecule affinityLCESIMSn） 快速筛选黄藤总生物碱中能够抑制乙酰胆碱酯酶活性的成分， 共筛选出12种具有潜在抑制乙酰胆碱酯酶的活性成分， 并鉴定了6种成分，分别为黄藤素 （Palmatine）、小檗碱 （Berberine）、药根碱 （Jatrorrhizine）、巴马汀红碱 （Palmatrubine）、7，8二氢8羟基小檗碱 （7，8Dihydro8hydroxyberberine）、Groenlandicine，结合体外酶学实验对这6种化合物进行了活性验证实验。结果表明，黄藤素抑制活性最强，其抑制作用强于阳性对照药盐酸多奈哌齐，说明黄藤素具有开发成抗阿尔茨海默症药物的潜力。本方法简单、快速、准确地从复杂的中药提取物中筛选出具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的成分，适用于复杂体系中的高通量筛选。

关键词靶向亲和液相色谱质谱联用技术； 黄藤总生物碱； 乙酰胆碱酯酶； 抑制剂

1引 言

阿尔茨海默病 （Alzheimer's disease， AD） 是以大脑中β淀粉样蛋白老年斑 （SPs） 沉积、神经纤维缠结 （Neurofibrillary tangles， NFTs） 和突触及神经元缺失为特征的一种神经系统退行性疾病，已成为威胁现代社会老年人健康的重大疾病之一[1]。针对AD的病理特征及病因所研发的药物中， 乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI）已广泛用于临床治疗AD。AchEI通过抑制体内AChE活性，减少乙酰胆碱分解，缓解AD对生活能力和认知能力的损害[2]。但已上市的AChEI如他克林、利斯的明等虽然有一定效果，但存在活性不强、副作用较大的缺点[3]。目前，从中药中寻找具有选择性强、副作用小的AChEI成为医药研究的热点[4～6]，同时也是治疗AD的研究中最活跃的领域。

黄藤为防己科天仙藤属植物黄藤（Fibraurea recisa Pierre.）的藤茎，收载于2015年版药典，具有清热解毒、泻火通便的功效，主要含有异喹啉类生物碱，具有抗真菌[7]、抗炎、抗肿瘤[8]等药理作用。本课题组前期研究发现[9]，黄藤总生物碱主要成分为黄藤素， 具有显著抑制AChE活性的作用。

靶向亲和技术主要利用亲和原理，将待测的具有潜在活性的小分子混合物与生物活性受体（主要是酶类）在接近生理条件下的缓冲液中混合，得到受体配体复合物和未结合的小分子化合物，通过超滤除去未结合的小分子，复合物经有机溶剂处理，将小分子配体释放出来，再通过LCMS技术，直接或者间接检测解离的复合物[10，11]。与传统生物活性筛选方法即在化合物库中逐一的筛选相比，此方法灵敏、快速，且不改变蛋白结构， 可以高通量地筛选出活性化合物[12，13]， 已广泛用于筛选与靶蛋白结合的药物中[14]，成为药物筛选的重要工具[6，15，16]。本研究采用靶向亲和液相色谱质谱联用技术筛选黄藤中能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性成分，筛选出12种具有潜在抑制乙酰胆碱酯酶的活性成分，并鉴定了其中6种化合物，为建立中药中乙酰胆碱酯酶抑制剂的快速筛选提供了科学依据。

2实验部分

2.1仪器与试剂

Agilent 1100 series LCMSD液相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司），包括：Agilent SL型多级离子阱质谱仪、低压四元梯度泵、二极管阵列检测器（DAD）、自动进样、柱温箱、Chemistation化学工作站等； BS124S电子天平（美国赛多利斯公司）； MR96A自动酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）； XL90超速离心机（美国Beckman公司）； 旋轉式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）； 尤尼柯UV2800紫外可见分光光度计（尤尼柯（上海）仪器有限公司）； RE5298型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

黄藤药材购于安国市瑞泰堂药材行，经吉林省中医药科学院赵全成研究员鉴定为防己科天仙藤属植物黄藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤茎； 黄藤素、盐酸药根碱、盐酸小檗碱均购于中国食品药品检定研究院（批号分别为：0732200005、110733201007、110713200609）； 巴马汀红碱、7，8二氢8羟基小檗碱、Groenlandicine（自制，纯度≥98%）。乙酰胆碱酯酶（来源于苍蝇头部， 上海源叶生物科技有限公司）； 碘化硫代乙酰胆碱（ATCI）、5，5二硫双（2硝基苯甲酸）（DTNB）（美国Sigma公司）； 盐酸多奈哌齐（卫材（中国）药业有限公司）； YM30离心超滤管（美国Millipore公司）； 24孔板，96孔板（美国Corning公司）； 乙睛、甲醇和甲酸均为色谱纯（美国Fisher公司）； 实验用水为娃哈哈纯净水； 其余试剂均为分析纯。

2.2黄藤总生物碱样品的制备

取黄藤药材2 kg，用10倍量的60%乙醇回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压浓缩得浸膏228.3 g。将浸膏加水溶解，通过预先处理好的D101大孔树脂柱（Φ100×10 cm），先用3倍柱体积水洗，再用8倍柱体积40%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，干燥，得黄藤总生物碱50.6 g。

取黄藤总生物碱适量，加0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 8.0）溶解，制成1.0 mg/mL的溶液，用于超滤实验和活性实验分析。取黄藤总生物碱适量，加甲醇溶解并配制成0.1 mg/mL溶液，用于液相色谱质谱联用分析； 黄藤素、盐酸药根碱、盐酸小檗碱、巴马汀红碱、7，8二氢8羟基小檗碱、Groenlandicine对照品用上述的0.1 mol/L PBS溶液配成1.0 mg/mL溶液，用于活性实验分析。

2.3乙酰胆碱酯酶（AChE）活性抑制实验

参照文献[17]方法并做适当调整，在96孔板中加入0. 1 mol/L PBS缓冲液（pH 8.0） 140 μL，待测样品溶液20 μL和0.5 U/mL酶溶液15 μL，混匀，在4℃放置20 min。加入2 mmol/L DTNB 10 μL和15 mmol/L ATCI 10 μL，37℃反应20 min，立刻测定405 nm处吸光度值。同时设立背景对照组和空白对照组。按下式计算酶活性抑制率（Enzyme activity inhibition ratio， EAIR）。

EAIR（%）=Ablank-（Asample-Abackground）Ablank×100%（1）

其中， Ablank表示不加样品体系的吸光度值； Asample表示为加入样品和酶的体系吸光度值； Abackground表示为不加酶的体系吸光度值。

样品组设定5个等梯度浓度，重复实验3次。以样品浓度（μg/mL）为横坐标，以AChE抑制率为纵坐标，绘制曲线，计算IC50。

2.4离心超滤筛选方法

参照文献[15，18]的方法，在24孔板中加入0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 8.0）300 μL、1 mg/mL黄藤总生物碱溶液100 μL、0.5 U/mL乙酰胆碱酯酶的酶液100 μL，37℃孵育30 min，转移至离心超滤管（YM30）中。12000 r/min离心20 min，加PBS缓冲液重复3次，每次500 μL，弃去离心液，再向超滤管中加入90%（V/V）甲醇500 μL，室温放置10 min后，离心15 min，重复3次，合并离心液，冷冻干燥后加40 μL甲醇/水（50∶50， V/V）溶解，用于LCMS/MS分析。同时设立空白对照组和阳性对照组。

同时，为了考察酶与底物的相互作用强度，设置了灭活酶的对照实验。AChE经100℃热灭活后，通过AChE的抑制率实验确定酶已失活。并称取等量的灭活酶同法处理进行实验，求出结合率（Binding degree， BD）[19]。

BD（%）= （Ab-Ac） /Aa×100%（2）

其中， Aa表示亲和离心超滤筛选前黄藤总生物碱溶液各化合物色谱峰面积； Ab表示亲和作用后活性酶结合的各相对应化合物的色谱峰面积； Ac表示变性失活酶结合的各相对应化合物的色谱峰面积。

2.5色谱与质谱条件

液相色谱条件： ACE C18色谱柱（250 mm× 4.6 mm， 5 μm）； 流动相： 乙腈0.1% H2PO4（每100 mL中加0.1 g 十二烷基硫酸钠）=36∶64（V/V）； 流速： 1 mL/min； 检测波长： 345 nm； 柱温： 30℃； 进样量： 10 μL。

质谱条件： 电喷雾离子源（ESI）； 正离子模式同时采集； 扫描范围m/z 50～1200； 目标分子量： 350 Da； 干燥气温度： 350℃； 干燥气流量： 10.0 L/min； 雾化气压强： 0.24 MPa； 毛细管电压： 4 kV。

3结果与讨论

3.1黄藤总生物碱的含量测定结果

参照文献[20]中总生物碱的测定方法，以黄藤素为对照品，采用0.05%溴甲酚绿为酸性染料进行染色，在200～400 nm波长范围内进行扫描，最终选择在345 nm测得2.2项下制备的样品中总生物碱的含量为97.5%。说明制备的样品主要成分为生物碱类成分，本研究所建立的提取方法可以作为黄藤总生物碱的提取方法。

3.2黄藤总生物碱的靶向亲和液相色谱质谱联用分析

黄藤总生物碱经亲和超滤实验共筛选出12种可能的AChE抑制剂（见图1A）。与黄藤总生物碱原溶液的HPLC色谱图（图1B）相比，在超滤实验条件下黄藤总生物碱中只有部分化合物能够与乙酰胆碱酯酶结合。并且与不加酶的空白对照试验的HPLC色谱图相比，说明本方法可以有效地避免由小分子化合物吸附到超滤膜上而造成假阳性（图1C）。 进行了黄藤总生物碱与灭活的乙酰胆碱酯酶的结合实验，依据色谱峰的峰面积与其在缓冲溶液中的浓度成正比，利用图1B和1D的HPLC色谱图中峰面积的变化情况来反映其对应的化合物与AChE的结合率[12]，求出各化合物与AChE的结合率均大于13.00%，这表明黄藤总生物碱中的活性成分能够与AChE有效结合（图1D）。对阳性对照药盐酸多奈哌齐进行了超滤实验（见图1E），结果表明， 超滤实验方法可行，具有较强的准确性。

采用HPLCDADESIMS2联用技术，在正离子模式下，通过自动二级质谱方式同时获取样品中生物碱类成分的一级和二级质谱图，根据每一成分的色譜保留时间、准分子离子峰和二级质谱碎片信息，参照ESIMSn数据、标准对照品及文献[7，21～23]数据进行对比，对其结构进行鉴定，确定了黄藤总生物碱中12种可能的AChE抑制剂，并且鉴定了其中6种化合物的的结构，分析结果见表1。

AbstractA target molecule affinityultrafiltration liquid chromatographyelectrospray ionization tandem mass spectrometric （LCESIMSn） method was established for rapid screening acetylcholinesterase （AChE） inhibitors from total alkaloids of fibraurea recisa Pierre. A total of 12 potential inhibitors were screened from Fibraurea recisa Pierre. and 6 compounds were identified including palmatine， berberine， jatrorrhizine， palmatrubine， 7，8dihydro8hydroxyberberine and groenlandicine. The AChE inhibitory activity of these 6 compounds was validated in vitro. Palmatine showed the strongest inhibitory activity for AChE， which was stronger than that of donepezil hydrochloride， demonstrating the potential of palmatine as antiAlzheimer's drug. This method is simple， rapid， and accurate for directly screening active ingredients which can inhibit AChE from complex extract of traditional Chinese medicines.

KeywordsTarget molecule affinityliquid chromatographytandem mass spectrometry； Total alkaloids of Fibraurea recisa Pierre.； Acetylcholinesterase； Inhibitor.