雷公藤内酯醇对足细胞EMT相关蛋白mRNA表达的影响

朱伶俐　叶迅

[摘要] 目的 通过观察雷公藤内酯醇（TP）对高糖刺激下ILK、MMP9、NEPH1蛋白表达的影响，探讨TP抑制足细胞上皮-间充质转分化（EMT）治疗糖尿病肾病的可能机制。 方法 将培养分化成熟的足细胞分为对照组（D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖组（D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）以及高TP组（25 mmol/L D-葡萄糖+ 32 ng/mL TP）。体外培养48 h后，倒置显微镜观察细胞形态，并采用PCR半定量分析技术检测ILK、MMP9、NEPH1的表达。 结果 高糖刺激下足细胞NEPH1的表达较对照组显著减少（P<0.01），而ILK、MMP9的mRNA表达较对照组显著升高（P<0.01）。各剂量TP组足细胞NEPH1 mRNA的表达均较高糖组明显上调（P<0.01），ILK、MMP9 mRNA的表达较高糖组明显下降（P<0.01），其中以中TP组的干预作用最显著（P<0.01）。 结论 TP可能通过抑制ILK信号通路来抑制足细胞EMT。

[关键词] 雷公藤内酯醇；足细胞；高糖；上皮-间充质转分化

[中图分类号] R197 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）31-0001-04

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一类以进行性肾脏纤维化为特征的疾病，是糖尿病最主要的微血管并发症之一。其最主要的临床表现为蛋白尿，而肾小球纤维化是产生蛋白尿的组织学基础。足细胞通过已分化上皮细胞向间充质细胞转分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影响肾小球滤过屏障功能和结构，使肾小球纤维化的重要因素[1]。其特点为失去上皮细胞特征如足细胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，导致成纤维细胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）、整合素连接激酶（ILK）、细胞外基质纤维连接蛋白（fibronectin，FN）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）等间充质细胞样表型标志物表达上调[2]。已发现的介导足细胞EMT的主要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。三条通路既有各自的信号传导路径，又在不同层面相互连接、整合，组成错综复杂的网络，共同调控足细胞的EMT过程。其中，ILK信号通路在足细胞EMT的过程中起重要的调节作用[3]。

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的干燥块根，中药学认为其味苦、辛，性寒，有大毒，归肝、肾经。功能祛风除湿 、通络止痛，兼杀虫解毒。临床主要用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾脏疾病等炎性和自身免疫性疾病。其用于治疗肾病已有30余年历史 ，从最初的生药煎剂到雷公藤提取物，取得了令人瞩目的疗效[4]。雷公藤内酯醇（triptolide，TP）是从其中分离所得的一种二萜类化合物，可通过靶向转录因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶体等机制发挥抑制细胞增殖和促肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用[5]。大量体内外研究均证实，雷公藤内酯醇具有保护足细胞、抑制蛋白尿的作用[6，7]。本研究观察TP通过对ILK信号通路的调节作用，干预高糖诱导小鼠足细胞EMT，探讨TP对高糖环境下受损足细胞的可能保护机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 细胞 本研究采用的小鼠肾小球足细胞为英国伦敦大学国王学院Guy's 医院赠送。

1.1.2 药物 葡萄糖（中国大冢制药有限公司），雷公藤内酯醇（杭州达文生物技术有限公司）。

1.2 仪器与试剂

超净工作台，空气过滤器（北京市昌平长城空气净化设备公司），恒温 CO2培养箱（B5060EK/CO2德国产），450 型自动酶标仪（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 仪，凝胶成像系统（ BIO-RAD），RPMI 1640培养液、胎牛血清（美国GIBCO公司），γ-干扰素（美国PEPROTECH公司），Trizol提取试剂盒（美国Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），引物合成（PRIMER5.0引物软件设计，上海生物工程公司合成），SDS-PAGE凝胶试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 复苏后的小鼠足细胞加入含有5 mL 10% FCS1640培养液的50 mL培养瓶中，每瓶加入500 U γ-干扰素。置33℃、5%CO2培养箱孵育，细胞增殖传代后，转移入37℃、5%CO2培养箱（含有5 mL 10%FCS1640培养液，不加干扰素）分化成熟（细胞形态表现为“树枝状”）。

1.3.2 实验分组 将分化成熟的足细胞接种至50 mL 细胞培养瓶，采用RandA 1.0软件完全随机分组法分为5 组，每组5 瓶细胞，对照组（Control Group：D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖组（HG：D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP组（LTP：25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP组（MTP：25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）和高TP组（HTP：25 mmol/L D-葡萄糖+32 ng/mL TP）。37℃、5%CO2培养箱孵育48 h后倒置显微镜下观察足细胞形态变化，并检测各组足细胞ILK、MMP9 和NEPH1的表达。

1.3.3 RT -PCR 半定量法检测ILK、MMP9、NEPH1 RNA 表达 Trizol 试剂和氯仿抽提足细胞总 RNA ，微量核酸测量仪测定每个RNA样品浓度（单位为μg/mL）；逆转录酶M-MuLV 催化下合成 cDNA；在DNA 自动扩增仪上进行 PCR 反应。25 μL反应体系中含10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物正反义链各10 pmol，TaqDNA 聚合酶（购自上海博亚）1.5 U，cDNA 1 μL，加去离子水至终体积25 μL，石蜡油封闭。阴性对照以双蒸水替代cDNA。聚合酶链反应（PCR）引物均根据已知的小鼠ILK、MMP9、NEPH1和GAPDH 的基因序列由 PRIMER 5.0 引物软件设计，由上海生物工程公司合成。见表 1。

1.3.4 扩增反应条件 在94℃ 2 min进行预变性后：（1）NEPH1：94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，进行35个循环。（2）ILK：95℃ 3 min，进入34个循环，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行34个循环。（3）MMP9： 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，进行33个循环。（4）GAPDH：94℃ 30 s、59.8℃ 30 s、72℃ 30 s，进行25个循环。完成循环后，在72℃ 2 min进行终延伸。各PCR产物与DNA Marker（购自上海生物工程公司）在1.7%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴化乙锭），0.5%TBE液中电泳（100 V，30 min），用BIO-RAD凝胶成像系统成像，凝胶定量软件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH为内参照基因，比较各目的基因条带与内参照基因条带的光密度比值。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差（x±s）进行统计学描述，对高糖组与对照组行t检验，高糖组与其余各组行单因素方差分析（ANOVA），方差齐时，两两比较采用LSD检验，方差不齐时用Tamhane检验，α=0.05。

2 结果

2.1 小鼠足细胞的形态学改变

倒置显微镜（放大倍数400倍）观察足细胞形态，发现对照组足细胞呈“分支状”，分步均匀，细胞与细胞之间以“树枝状”足突相连，生长旺盛；高糖刺激48 h后，足细胞足突短少，局部聚集；低TP组可见足细胞形态尚可，足突较对照组短少，贴壁一般，生长尚可；中TP组足细胞足突较对照组少，但较高糖组多，细胞生长旺盛；高TP组足细胞形态尚可，足突粗短，部分细胞聚集。由封三图1可见，对照组足细胞形态呈分化成熟的“树枝状”，生长旺盛，而高糖组足细胞足突短少，且有部分细胞死亡。与高糖组比较，细胞形态上，TP各组细胞足突均增多，尤以中TP组明显；细胞生长方面，低TP组和中TP组细胞生长旺盛，高TP组细胞部分聚集，与高糖组相似。

2.2 对高糖刺激下足细胞ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表达的影响

与对照组比较，高糖组ILK mRNA及MMP9 mRNA表达显著升高（P<0.01），NEPH1 mRNA的表达显著降低（P<0.01）。与高糖组比较，不同剂量的TP均能显著降低ILK mRNA及MMP9 mRNA的表达（P<0.01），其中以中TP组的降低最明显（P<0.01）。与高糖组比较，不同剂量的TP均能显著上调NEPH1 mRNA的表达（P<0.01），其中以中TP组的升高最明显（P<0.01）。见表2、3，封三图 2、3。

3 讨论

糖尿病肾病（DN）是糖尿病的主要并发症之一，其特征性的临床表现即蛋白尿，而蛋白尿的形成与肾小球滤过屏障功能和结构密切相关。足细胞EMT是影响肾小球滤过屏障功能的关键病理学变化，是引发早期蛋白尿的主要原因[8]。研究表明，通过抑制足细胞的EMT，可使足细胞能恢复至正常的上皮细胞表型[9]。

已发现的介导足细胞EMT的主要信号通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三条。ILK信号通路中，ILK是一种存在于细胞胞质中的丝/苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞内外信号传导通路形成的重要介质，调节细胞黏附、生存、分化和凋亡，在维持足细胞生物学特性上有重要意义[3]。ILK可与nephrin相互作用，从而建立起连接细胞-基质integrin信号通路与细胞-细胞信号通路的分子桥梁，可直接磷酸化下游几个重要的激酶，包括Akt和GSK-313，导致β-catenin的稳定[10，11]。有研究发现激活的ILK能直接磷酸化糖原合成酶激酶-3（glyeogen synthase kinase-3，GSK-3），后者的磷酸化可激活活化蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1），使MMP9的表达增加[12]。目前认为[13]ILK信号通路的失调，是引起慢性肾炎以及肾脏纤维化的重要原因。通过抑制ILK来达到延缓或逆转EMT成为研究热点。Huber MA等[14]通过研究体内给予ILK小分子抑制剂可减少白蛋白尿，能减少足细胞上间质细胞标志物α-SMA和MMP9的表达，恢复足细胞特异性标志物nephrin的表达，保护足细胞免受损伤，从而保护肾小球滤过屏障功能。

肾小球足细胞发生EMT后间充质细胞的表面标志物之一的MMP9，是以Ⅳ型胶原为主要降解底物的明胶酶。足细胞发生EMT时，MMP9的表达显著增高，造成基底膜Ⅳ型胶原合成和分解失平衡，进而引发肾小球滤过膜、肾小球系膜病理学改变。

肾小球足细胞相关蛋白1（NEPH1）是一种在足细胞裂孔隔膜上表达的跨膜蛋白，具有组成滤过屏障和信号转导等功能。它与nephrin有密切的相互作用，极可能与nephrin有同源性或相似性[15]。与nephrin类似，NEPH1能以相互交错的形式形成拉链样结构，起到分子屏障作用，是维持裂孔隔膜的完整性及滤过屏障的重要蛋白[16]。研究表明，NEPH1可以有效保护足细胞，防止损害。调节NEPH1的表达，已成为保护足细胞的治疗新法[17]。

雷公藤制剂治疗糖尿病肾病已在临床上广泛应用，而其作用机制尚需探讨。已有研究证实，雷公藤甲素可上调高糖诱导的足细胞nephrine 和podocin mRNA及其蛋白表达[18]。此外，TP还通过调节Smad信号途径减轻肾脏纤维化程度[19]。也有研究发现，TP能够有效遏制p-38 MAPK信号通路的活化，显著降低p-38 MAPK的磷酸化水平，从而保护足细胞[20-24]。然而，目前尚缺乏对TP调节ILK信号通路体外干预足细胞EMT的研究。本实验通过研究其对高糖诱导下足细胞的ILK、MMP9、NEPH1的表达调节的影响，进一步了解雷公藤治疗糖尿病肾病的机制。

本研究发现，在25 mmol/L高糖诱导下足细胞发生了EMT，表现为NEPH1表达明显降低，而足细胞的ILK、MMP9的表达显著升高，提示足细胞的EMT过程中，ILK通路被过度激活，使MMP9表达升高，破坏基底膜Ⅳ型胶原合成和分解平衡，影响了足細胞的结构稳定。使用不同剂量TP干预高糖诱导下的足细胞与高糖组比较，ILK、MMP9的表达均有不同程度的下调，NEPH1的表达则呈不同程度的上调；尤以中TP组（16 ng/mL）的表达变化最显著。

本研究表明TP可通过有效降低ILK表达，抑制ILK信号通路的活性，从而减少ILK参与其他诱导足细胞EMT信号通路的影响，进而降低MMP9的表达，维持足细胞基底膜的完整性，同时上调受高糖影响而被抑制的NEPH1表达。提示TP可通过调节ILK、MMP9和NEPH1表达来抑制足细胞受高糖诱导的EMT，从而保护高糖环境下受损的足细胞，减少蛋白尿的产生，延缓糖尿病肾病的进展。而本研究提示以中剂量TP干预效果最明显，并非呈剂量依赖性。高剂量TP的疗效反而减弱，这是否与其细胞毒性有关，尚需进一步研究证实。

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（收稿日期：2016-07-11）