藏药绿萝花水提物对成纤维细胞线粒体抗氧化作用的研究

韩金潭，孙翠翠，丁淑梅，顾员印，刘 群*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.四川金科药业有限公司，四川成都 610100)

藏药绿萝花水提物对成纤维细胞线粒体抗氧化作用的研究

韩金潭1,2，孙翠翠1，丁淑梅1，顾员印1，刘 群1*

(1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041；2.四川金科药业有限公司，四川成都 610100)

为探讨不同浓度的绿萝花制剂对线粒体的抗氧化作用及毒理作用，以小鼠胚胎成纤维细胞及其线粒体为研究对象，在最大无毒作用浓度(TC0)的基础上设计3个浓度药物组，在TC0下设计6个浓度药物组，以成纤维细胞线粒体膜电位(MMP)和线粒体总活性氧含量(ROS)为检测指标，在4个不同作用时间点，研究绿萝花对成纤维细胞线粒体的影响。结果表明，绿萝花制剂对鼠胚成纤维细胞(MEF)的TC0为0.25 g/mL，但ROS已急剧上升，MMP下降；绿萝花浓度为0.03 g/mL时，抗氧化能力最强，随着浓度的上升(0.03 g/mL～0.25 g/mL)，线粒体抗氧化能力减弱或消失；随着给药浓度的升高，细胞凋亡现象出现趋势明显，浓度高于TC0时，表现出毒性作用，浓度升高，毒性增大。绿萝花干膏制剂0.03 g/mL(以生药含量计算)具有抵抗由H2O2引起的MEF线粒体MMP下降和ROS的升高的功能，表现出一定的抗氧化能力和阻滞细胞凋亡发生的作用；TC0及之上浓度具有细胞毒性作用。

绿萝花；成纤维细胞；线粒体；膜电位；活性氧

藏药绿萝花为天南星科喜林芋属植物绿萝花的干燥花蕾，为西藏特有的二级保护珍贵药材，民间习以泡水饮用，用以糖尿病、高血压、高血脂、冠心病及各种血管脉管炎症等的防治。目前关于绿萝花的研究报道较少，仅局限于几种化学成分提取工艺研究[1]；药理研究表明绿萝花具有增强机体对糖的耐受能力、抑制机体对葡萄糖的吸收[2-3]；降低糖尿病大鼠血糖含量，改善高血糖脂模型大鼠血糖、血清总胆固醇、低密度脂蛋白、动脉粥样硬化指数的异常，降低空腹血糖指标、升高胰岛素含量等作用[4-5]；增强机体免疫功能和抗肿瘤生长的作用[6]；增强机体组织器官抗氧化能力的作用[7-10]。本研究以小鼠胚胎成纤维细胞及其线粒体为研究对象，在最大无毒浓度基础上下设计不同浓度药物组，以成纤维细胞线粒体膜电位(MMP)和线粒体总活性氧含量(ROS)为检测指标，在不同作用时间点，研究绿萝花对成纤维细胞线粒体的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 怀孕母鼠(由成都达硕生物科技有限公司提供，批号：0014312)。

1.1.2 试验药材 绿萝花(Scindapsusaureus)干燥花蕾，由四川宇妥藏药药业有限责任公司提供，由西南大学园艺园林学院鉴定(鉴定人:李先源)，室温密封干燥保存。

1.1.3 试剂与仪器 细胞存活率、线粒体膜电位检测试剂盒,上海碧云天生物科技有限公司产品产品；BB15型CO2培养箱，THERMO公司产品；IX71型倒置显微镜，OLYMPUS公司产品；DU800型荧光分光光度计，BECKMAN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 绿萝花干膏制剂的制备 参照康莲莲[11]等水提工艺制备绿萝花干膏制剂：浸泡0.5 h、20倍加水量、1 h煎煮时间、煎煮3次，制备干膏剂，干膏得率23.2 %，4℃冰箱保存。PBS缓冲液制成相当于生药100%浓度的绿萝花干膏制剂溶液，现配现用。

1.2.2 TC0测定 先进行鼠胚成纤维细胞(MEF)的制备及培养，当MEF传代培养3次后进行计数并稀释到细胞量约为4×106个/mL～6×106个/mL，分于25 cm细胞培养瓶中，37℃恒温箱中培养；将单层的细胞消化下来并接入96孔细胞培养板内培养，长满单层后，分为试验组和对照组。试验组：弃原培养液，分别加入生药含量浓度为100%、50%、25%、12.5%、6.25%绿萝花药液100 μL，每浓度复6孔。对照组：不进行任何处理。置37℃、5% CO2培养箱中培养3 d后，镜下观察，与对照组细胞相比无退变、变形和脱落的药物稀释度为绿萝花对MEF的TC0。

1.2.3 TC0以下不同浓度绿萝花制剂对MEF的影响 阳性对照组：无菌条件下，将不同浓度药物培养液(以TC0为1个浓度，向下作2倍梯度稀释成6个不同浓度)接入已长满单层细胞的25 cm细胞培养瓶内，每瓶约1 mL，以铺满瓶底为宜，每浓度重复7瓶，37℃孵育2 h后，弃含药培养液，20% H2O2作用5 min；阴性对照组：不进行任何处理。同时消化收集阴性、阳性对照组细胞，离心，弃上清，PBS洗1次，进行膜电位及ROS的测定。

1.2.3.1 MMP的测定 阳性对照组：加入凋亡诱导剂0.1 mmol/L缬氨霉素，诱导细胞凋亡；阴性对照组：不做处理。阴性、阳性对照组同时进行染色处理，按照线粒体膜电位检测试剂盒操作步骤，用荧光分光光度计检测分析。

1.2.3.2 ROS的测定 参考总活性氧检测试剂盒操作步骤，收集不同浓度药物作用后的细胞及阴性、阳性对照细胞，用荧光分光光度计(荧光酶标仪)定量检测各组细胞荧光强度(DCFH-DA荧光探针激发波长488 nm，发射波长525 nm)。

1.2.4 TC0以上不同浓度绿萝花对MEF的影响 以TC0为1个浓度，向上设3个2倍浓度梯度的绿萝花药液浓度。诱导细胞凋亡处理方法、MMP及ROS的测定方法同1.2.4。

1.2.5 不同作用时间下绿萝花对MEF的影响 绿萝花干膏用细胞维持液(PBS)溶解稀释为2TC0、1TC0、1/2TC0三个浓度，参照1.2.4的处理方法，37℃分别孵育0.5、1、1.5、2 h后，弃含药培养液，消化、清洗、收集细胞(连上清一起收集)，进行MMP及ROS的测定。

2 结果

2.1 TC0测定结果

绿萝花干膏对MEF的最大无毒作用浓度为25%，即TC0=0.25 g/mL。

2.2 TC0下浓度对MEF的影响

TC0下不同浓度绿萝花对MEF的MMP、ROS影响的统计结果见表1。

表1表明，小鼠成纤维细胞线粒体膜电位(MMP)在H2O2作用下急剧下降，极显著低于阴性对照组和各药物组(P<0.01)，各药物组的MMP虽然低于正常细胞的MMP，但却极显著高于阳性对照组(P<0.01)；2-2～2-5的药物组MMP无显著性差异(P>0.05)，但其中2-3药物组的MMP显著高于2-1(P<0.05)，极显著高于20药物组(P<0.01)。

表1 TC0下不同浓度绿萝花对MEF的影响相关指标

注:同列数据肩上标有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同小写字母表示差异显著(0.01

Note:Values with same small letters in the same column mean no significant difference(P>0.05),with different small letters mean significant difference(0.01

表1表明，小鼠成纤维细胞线粒体总活性氧(ROS)在H2O2作用下急剧上升，极显著高于阴性对照组和各药物组(P<0.01)，各药物组的ROS虽然高于正常细胞的SOR，但却极显著低于阳性对照组(P<0.01)；2-2～2-4的药物组ROS无显著性差异(P>0.05)，但其中2-3药物组的ROS极显著低于20和2-1(P<0.01)和极显著低于2-4和2-5药物组(P<0.01)。

2.3 TC0上浓度对MEF的影响

TC0上不同浓度绿萝花对MEF线粒体MMP、ROS影响的统计结果见表2。

表2表明，小鼠成纤维细胞线粒体膜电位(MMP)在H2O2作用下急剧下降，极显著低于阴性对照组(P<0.01)，3个高浓度药物组的MMP虽无统计学意义(P>0.05)，但随着药物浓度的加大，MMP呈下降趋势(23浓度低于22，22浓度低于21的MMP)，且明显低于阴性对照组(P<0.01)；虽然22和23浓度的MMP平均值高于阳性对照组，但与阳性对组比较无显著性差异(P>0.05)，结合表1，TC0上3个不同浓度的线粒体MMP极显著低于TC0下6个不同浓度的MMP。小鼠成纤维细胞线粒体活性氧(ROS)含量在H2O2作用下急剧上升，极显著高于阴性对照组(P<0.01)，3个高浓度药物组的ROS随着药物浓度的加大，ROS呈急剧上升趋势：23浓度高于22(P<0.01)，22浓度高于21的ROS(P<0.01)，虽然明显低于阳性对照组(P<0.01)，但有达到阳性对照组的趋势，结合表1和图2，TC0上3个不同浓度的线粒体ROS极显著高于TC0下6个不同浓度的ROS。

2.4 不同作用时间对MEF的影响

不同作用时间下绿萝花对MEF线粒体MMP、ROS影响的统计结果见表3。

表3表明，20TC0(1TC0)浓度作用0.5、1.0、1.5、2.0 h，小鼠成纤维细胞线粒体MMP有下降趋势，但变化不大，无统计学意义(P>0.05)(线粒体膜电位随作用时间增长逐渐降低)；2-1TC0(1/2TC0)浓度作用0.5 h～2.0 h，小鼠成纤维细胞线粒体MMP有先呈下降后上升趋势，但差异不显著(P>0.05)；21TC0(2TC0)浓度作用0.5 h～2.0 h，小鼠成纤维细胞线粒体MMP有呈下降趋势，且作用2 h的MMP明显低于0.5 h的MMP(P<0.05)；3个浓度药物分别作用0.5 h～2.0 h的4个检测点，尽管小鼠成纤维细胞线粒体MMP无统计学意义(P>0.05)，但2 TC0的MMP绝对平均值均低于1 TC0、1/2 TC0的MMP。试验结果表明，在最大无毒浓度之上，绿萝花能引起小鼠成纤维细胞线粒体膜电位的下降并随着作用时间的延长而呈下降趋势。

表2 TC0上不同浓度绿萝花对MEF的影响相关指标

注:同列数据肩上标有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同小写字母表示差异显著(0.01

Note:Values with same small letters in the same column mean no significant difference(P>0.05),with different small letters mean significant difference(0.01

表3 不同作用时间下绿萝花对MEF线粒体膜电位的影响±SD,n=7)

注:同列、行数据肩上标有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同小写字母表示差异显著(0.01

Note:Values with same small letters in the same column and row mean no significant difference(P>0.05),with different small letters mean significant difference(0.01

表4 不同作用时间下绿萝花对MEF线粒体总活性氧含量的影响±SD,n=7)

注:同列、行数据肩上标有相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，标有不同小写字母表示差异显著(0.01

Note:Values with same small letters in the same column and row mean no significant difference(P>0.05),with different small letters mean significant difference(0.01

表4表明，2-1TC0(1/2TC0)浓度作用0.5 h～2.0 h的4个检测点小鼠成纤维细胞线粒体总活性氧(ROS)含量变化不大，无统计学意义(P>0.05)；20TC0(1TC0)浓度作用0.5 h～2.0 h，ROS呈上升趋势，作用1.5 h的ROS显著高于作用0.5 h(P<0.05)，作用2.0 h的ROS显著高于作用1.0 h(P<0.05)、极显著高于0.5 h的ROS(P<0.01)；21TC0(2TC0)浓度作用1.0 h～2.0 h的ROS极显著高于作用0.5 h的ROS，作用2.0 h，其ROS极显著高于作用0.5 h～1.5 h的ROS(P<0.05)；3个浓度药物分别作用0.5 h～2.0 h的4个检测点，21TC0(2TC0)的ROS均极显著高于20TC0(1TC0)的ROS(P<0.01)，20TC0(1TC0)的ROS均极显著高于2-1TC0(1/2TC0)的ROS(P<0.01)。试验结果表明，在最大无毒浓度作用下，小鼠成纤维细胞线粒体总活性氧含量已急剧上升并随着作用时间的延长而呈上升趋热，超过最大无毒浓度，作用更加明显。

3 讨论

3.1 绿萝花对小鼠胚胎成纤维细胞线粒体的影响

细胞凋亡是机体在多种调控因子相互作用下产生的一种可控性的细胞死亡。目前细胞凋亡通路研究资料表明[12]，线粒体跨膜电位其崩坏被定为细胞凋亡最早阶段，膜电位剧变，细胞凋亡不可逆转，因此MMP降低是细胞凋亡先期的一个重要指征，是药物细胞毒性灵敏指标[13-15]。线粒体是细胞内ROS产生的主要细胞器，活性氧严重增加造成细胞广泛性氧化损伤，如激活MPTP的开放、线粒体呼吸链断裂、细胞色素C释放等从而启动细胞凋亡程序，诱导细胞凋亡产生。

本研究在倒置相差显微镜下观察小鼠胚胎成纤维细胞贴壁生长，以细胞体积大小均匀、细胞膜完整无发泡现象、贴壁细胞无皱缩变圆脱落等为判定指标，获得绿萝花对细胞的最大无毒作用浓度(TC0)为25%。研究结果表明，20%的H2O2能引起小鼠成纤维细胞线粒体MMP急剧下降和ROS含量急剧上升从而诱导细胞凋亡的发生；绿萝花干膏制剂浓度在20～2-5TC0时均能增强线粒体抵抗H2O2引起的膜电位下降和活性氧升高的作用从而阻止细胞凋亡进程的发生，随着绿萝花浓度降低至2-3TC0，线粒体MMP逐步升高，ROS含量逐步下降，之后随着绿萝花浓度再次下降，线粒体MMP又逐步下降，ROS含量逐步升高，即绿萝花浓度在3.13%～25%时，表现出一定的抗氧化能力，浓度为3.13%时，抗氧化能力最强，低于3.13%时则抗氧化能力下降并消失；绿萝花干膏制剂浓度在21～23TC0时均能引起线粒体膜电位的下降和活性氧的升高，且随着药物浓度的增加其作用接近20%的H2O2引起的诱导细胞凋亡发生作用，即在TC0上，随着给药浓度的升高，细胞凋亡现象的出现越趋明显，浓度高于25%时，表现出一定的毒性作用，浓度升高，毒性作用增大；在TC0及之上浓度作用下，随着作用时间延长，小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位下降，总活性氧含量上升，并随着作用时间的延长，这种作用更加明显(活性氧指标变化优于膜电位指标)，说明绿萝花在最大无毒作用浓度之上对线粒体膜电位和活性氧含量的影响已表现出细胞毒性作用，值得注意的是，绿萝花在最大无毒作用浓度(25%)下，虽未发现成纤维细胞变形、体积变小、细胞膜发泡状态和凋亡小体的现象出现，但已出现膜电位下降和活性氧上升，已对细胞表现出一定的毒性作用。本研究结果表明，绿萝花干膏制剂3.13%(以生药含量计算)具有抵抗由H2O2引起的小鼠胚胎成纤维细胞线粒体膜电位下降和总活性氧的升高，表现出一定的抗氧化能力和阻滞细胞凋亡发生的作用，但随着作用浓度的增加这种作用减弱或消失，膜电位下降，活性氧含量上升，在最大无毒作用(25%)及之上浓度更为明显，表现出一定的细胞毒性作用并随着作用的间的延长，其毒性作用增强。

3.2 关于中药最大无毒作用浓度的讨论

本研究的目的是探讨绿萝花在对细胞最大无毒作用浓度下作用于小鼠胚胎成纤维细胞线粒体的抗氧化作用和在最大无毒作用浓度之上对线粒体的毒性作用。研究结果表明，20% H2O2作用于成纤维细胞5 min可使线粒体膜电位急剧下降和总活性氧急剧上升，随着绿萝花浓度从25%下降至3.13%，线粒体抗氧化作用增强，3.13%的绿萝花浓度作用细胞2 h，线粒体抗氧化作用最强，随后减弱或消失；随着绿萝花浓度从25%上升到50%，线粒体膜电位下降，活性氧含量上升，表现为毒性作用，即使是在最大无毒作用剂量下，尽管膜电位指标下降不明显，但活性氧极显著高于2-1TC0浓度的活性氧含量，说明中药对细胞在最大无毒作用浓度下，成纤维细胞虽无表现的直接变化，但线粒体的功能已受影响，而线粒体在调节细胞凋亡过程中发挥着关键作用，其膜电位与总活性氧含量指标变化是先于细胞凋亡的敏感指标。随着科学技术和认识水平的提高，有关对中药最大无毒作用及中药对机体不良反应、毒性反应的认识有待于进一步提高。

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Effect of Water Extract of Tibetan MedicineScindapsusaureuson Mitochondrial Antioxidant Effect of Fibroblasts

HAN Jin-tan1,2,SUN Cui-cui1,DING Shu-mei1,GU Yuan-yin1,LIU Qun1

(CollegeofLifeScienceandTechnology,SouthwestUniversityforNationalities,ChengduSichuan610041,China)

In order to explore the effects of water extracts ofScindapsusaureasin different concentrations on the antioxidant and toxicological effects of mitochondria of mouse embryonic fibroblasts(MEF),three group concentrations of water extracts ofScindapsusaureaswerewere set up based on above maximam non-toxic concentration(TC0),and six group concentrations of water extracts ofScindapsusaureaswere set up based on undex TC0.The effects ofScindapsusaureason the mitochondria of MEF were studied based on the mitochondrial membrane potential(MMP) of MEF and mitochondrial total reactive oxygen species(ROS) at four different time points.The results showed the TC0of water extracts ofScindapsusaureasto MEF was 0.25 g/mL,but ROS rose sharply,MMP decreased.The maximum antioxidant capacity reached when the extract concentration is 0.03 g/mL,the antioxidant capacity decreased or disappeared along with the rising the extract concentrations,and cell apoptosis appeared.The cytotoxicity appeared when the concentration was higher than TC0,the higher the concentration,the more the toxicity.The preparation of 0.03 g/mL water extracts ofScindapsusaureascan prevent MMP of MEF from decline and ROS from rise induced by H2O2.This antioxidant capacity can block the cell apoptosis,but it may cause the cytotoxicity when the extract concentration is above TC0.

Scindapsusaureus; fibroblast; mitochondria; membrane potential; reactive oxygen species

2016-06-05

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD34B02-4)；西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2015SZ090)

韩金潭(1990-)，女，河北衡水人，硕士研究生，主要从事中药药理学研究。*通讯作者

S859.7

A

1007-5038(2017)02-0055-05