中蜂雄蜂精液与工蜂中蜂囊状幼虫病毒的检测

宋文菲，杨 爽，苗春辉，梁 铖，张学文

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

中蜂雄蜂精液与工蜂中蜂囊状幼虫病毒的检测

宋文菲，杨 爽，苗春辉，梁 铖，张学文*

(云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

为了解同群中蜂雄蜂精液及工蜂中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)的感染情况，寻找CSBV交尾传播的间接证据，利用RT-PCR方法对云南省蒙自市东村的3个中蜂群雄蜂精液及工蜂样本的CSBV进行检测。结果显示，3个蜂群的工蜂均被检测出携带CSBV，相对应的本群雄蜂精液样本也被检测出携带CSBV，二者呈正相关关系，雄蜂精液样本的平均感染率达到93.33%。结果表明，雄蜂精液是CSBV的携带者，为CSBV的交尾传播提供了间接证据。

中蜂囊状幼虫病毒；雄蜂；精液；工蜂；RT-PCR

中蜂囊状幼虫病(Chinese sacbrood disease,CSBD)简称中囊病，是由中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)感染引起的肠道传染性疾病，因其症状主要见于幼虫，染病幼虫不能成功化蛹，蜕皮液集聚在其表皮处，形成囊状而得名。成年蜜蜂也会感染病毒，虽然不会很快死亡，但会影响其抗病能力，极易感染其他病毒。该病已成为中蜂的主要病害之一，常发生在春繁季节，此时蜂群发展最快，存在大量易感的幼虫和年轻工蜂。该病毒是一类小核糖核酸病毒[1]，与蜜蜂囊状幼虫病毒(Sacbrood bee virus,SBV)为同一病毒属内的2种不同病毒株，是造成蜂群数量下降的6种主要蜜蜂病毒病之一[2]。蜜蜂病毒的传播方式是扩大病毒感染范围并造成蜂群大面积毁灭的重要途径，包括水平传播和垂直传播。水平传播是指病毒在同一世代的蜜蜂个体中进行传播，可分为直接与间接2种，直接传播包括空气传播感染、食物传播感染、交尾传播感染；间接传播是指通过起媒介作用的生物宿主进行传播。垂直传播则是发生在亲代与子代间的传播，即可通过亲代的卵把病毒传播给子代。

交尾传播在严格意义上虽归于水平传播，但正是交尾传播的发生，才导致亲代与子代间的垂直传播，所以交尾传播是介于两种传播途径之间。2006年，Yue C等[3]在西方蜜蜂雄蜂精液中检测到RNA病毒急性蜜蜂麻痹病毒(Acute bee paralysis virus, ABPV)及与CSBV同属于传染性软腐病病毒属Iflavirus的蜜蜂残翅病毒(Deformed wing virus, DWV)，并测得病毒序列，证实了蜜蜂病毒交尾传播方式的存在。de Miranda J R等[4]利用蜜蜂人工授精技术发现DWV的交尾传播和垂直传播方式是相关联的，Yaez O等[5]发现高DWV滴度并不会影响雄蜂到达雄蜂聚集区参加与蜂王的交配，证实在自然交尾中通过雄蜂进行的交尾传播方式。而关于中蜂雄蜂是否会携带CSBV及验证CSBV交尾传播的研究还未见报道，因此，基于西方蜜蜂病毒病方面的研究，本研究利用RT-PCR技术检测同群中蜂雄蜂精液及工蜂的CSBV带毒情况，以求为CSBV的交尾传播提供间接证据，为进一步系统地研究该病的交尾及垂直传播提供前期基础，进而为抗病毒中蜂优良品种的培育研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 时间与地点 样品采集时间为CSBV高发的秋季，时间为2015年9月21日。采集地点为云南省红河州蒙自市东村，平均海拔1 280 m。

1.1.2 样品采集 蜂种为滇南中蜂，每群随机取活体样品成年工蜂5只，同时每采取5只雄蜂精液为1个样品，每群采取5个样品，共3群(由于本所内中蜂场当时没有雄蜂，本次样本是在自家院子内养的蜂群，且只有3群，也符合统计样本标准，故在有限的时间内只能选择这3群样本作为本次试验样本)，置-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取 参照文献[6]方法，并加以改进。具体步骤如下：每群取5只工蜂样品，取1只置于1.5 mL离心管内，加入1 mL Trizol，用玻璃研棒充分匀浆，静置5 min。加入200 μL氯仿，充分震荡，静置2 min。4℃、12 000 r/min离心15 min；取上清液400 μL～600 μL，加氯仿200 μL，混匀静置5 min；4℃、12 000 r/min离心10 min；取上清液200 μL～300 μL，加入等量的异丙醇，混匀，静置10 min；4℃、12 000 r/min离心10 min；沉淀以750 mL/L乙醇洗涤；4℃、12 000 r/min离心5 min；倒去乙醇，真空抽干，用40 μL DEPC处理水溶解，置-80℃保存备用。精液样品的总RNA提取也同上，只是精液样品在研磨时，用力较轻。

1.2.2 RT-PCR扩增 引用文献中SBV片段SB1-2引物SBV-F(5′-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3′)，SBV-R (5′-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3′)[7]。RT-PCR 反应体系为：20 μL 体系中含有RNase Free ddH2O 8.7 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，10×One step RNA PCR buffer 2 μL，dNTP Mixture各(10 mmol/L) 2 μL，RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.3 μL，AMV Reverse Transcriptase XL(5 U/μL) 0.3 μL，AMV-OptimizedTaq

(5 U/μL) 0.3 μL，上、下游引物各0.8 μL，总RNA 0.8 μL。反应条件：50℃ 30 min；94℃ 2 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共35个循环；4℃结束反应。取PCR产物5 μL用20 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果

2.1 同群雄蜂精液与工蜂的RT-PCR检测结果

RT-PCR扩增的产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测的结果见图1、图2和图3。所选引物预期的扩增片段长度为487 bp。图1为1、2号群工蜂感染CSBV情况，其中1～5样品为1号群工蜂，6～10样品为2号群工蜂，除样品5未检测出CSBV外，其余9个样品均有不同程度的CSBV感染。图2为1、2号群雄蜂精液感染CSBV情况，其中1～5样品为1号群雄蜂精液，6～10样品为2号群雄蜂精液，电泳结果显示所有 10个样品均有不同程度的CSBV感染。图3为3号群雄蜂精液和工蜂感染CSBV情况，其中1～5样品为3号群雄蜂精液，6～10样品为3号群工蜂，除样品3未检测出CSBV外，其余9个样品均有不同程度的CSBV感染。结果表明，在3群工蜂被检测出CSBV感染时，相对应的该群雄蜂精液也被检测出CSBV感染，二者呈正相关性。

M.DNA标准DL 1 000; 1～4、6～10.感染CSBV的样品(487 bp)；5.未感染CSBV的样品

M.DNA标准DL 1 000; 1～10.感染CSBV的样品(487 bp)

M.DNA标准DL 1 000; 1～2、4～10.感染CSBV的样品(487 bp)；3.未感染CSBV的样品

2.2 CSBV感染率

通过检测，发现3群中蜂雄蜂精液和工蜂样品均不同程度地感染了CSBV，每群的平均感染率在90%以上，甚至可以达到100%(表1)，总的平均感染率为93.33%。

表1 3群中蜂蜂群雄蜂精液、工蜂感染CSBV情况

3 讨论

中蜂是我国的本土蜂种，蜂种多样性极其丰富，中国畜禽资源遗传志(蜜蜂志)中共收录9种地理型中蜂蜂种，不仅提供着高价值的蜂产品，其授粉行为还创造了巨大的农产品增收效益和无法估量的生态效益。中囊病不但严重威胁着中蜂养殖业的发展，而且也严重影响虫媒植物的生长，破坏了生态平衡。该病在我国发病最重，自20世纪70年代初暴发以来，在近10年里，造成近百万群中蜂损失，目前仍然是威胁我国中蜂饲养及种群发展的重要病害[7]。由于国内蜜蜂病毒病的流行与分子传播机制尚无明确的定论，生产实践中还未找到行之有效的防治方法。目前，对CSBD的防控措施的研究报道多局限在发病后，采取药物、加强饲养管理、换王断子等，而从病毒的传播途径角度寻找解决方法的研究却鲜有报道。雄蜂在蜜蜂群体中只是起到交配的作用，它不能自己觅食，只能取食工蜂贮藏于蜂巢中的食物，一旦交配季节度过，在缺乏蜜粉时它就会被工蜂驱赶，并被活活饿死。本研究首次在中蜂雄蜂精液中检测到CSBV,研究结果表明工蜂可通过食物接触等方式将病毒传播给雄蜂，进而雄蜂可通过与处女蜂王的交尾行为将病毒传播给蜂王。

自从2006年北美及欧洲暴发“蜂群崩溃失调症”(Colony collapse disorder，CCD)，蜜蜂病毒病更加引起人们的重视[8]。因此，病毒的传播方式也成为了研究者研究疾病防控的一个重要方面。研究发现，西蜂蜂群内的蜂螨是重要的蜜蜂病毒传播媒介，并影响着病毒的地理流行病学[9-10]。2006年，Chen Y P等[11]首次对蜜蜂群内包括SBV在内的6种病毒垂直传播方式进行了研究，证实了蜜蜂病毒病可通过蜂王传播给其子代。传播方式的研究，看似为防治蜜蜂病毒病提供了新的解决措施，但应从哪一方面进行疾病防控还未有定论。我国是蜜蜂疾病流行与暴发最为严重地区之一，每年因疾病流行损失大量饲养蜂群，疾病的广泛传播成为我国蜜蜂生物多样性快速下降的一个主要因素[12]。蜂王与多个雄蜂的自由交配行为对于蜜蜂疾病的传播是一种固有风险[13]，因为雄蜂可以访问距其蜂群8 km的聚集地，在雄蜂聚集区有大量不同蜂场和蜂群的雄蜂，而要控制蜜蜂交配，就需要有半径20 km以上的隔离区，实际养殖中却很难满足这一要求，一旦雄蜂染病，极易造成疾病大范围传播。因此，雄蜂是否会携带病毒对病毒病防控是至关重要的，本文研究结果证实了看似健康的雄蜂是CSBV的携带者，为CSBV交尾传播方式提供了间接证据。但要搞清CSBV交尾传播方式及与CSBV大范围传播之间的相互关系，还需要通过蜜蜂人工授精及其他分子生物学手段进行系统的研究。

[1] 李 薇,薛 菲,Wubie A J,等.蜜蜂囊状幼虫病研究进展[J].动物医学进展,2014,35(6)：117-122.

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[3] Yue C,Schröder M,Bienefeld K,et al.Detection of viral sequences in semen of honeybees(Apismellifera):Evidence for vertical transmission of viruses through drones[J].J Inverteb Pathol,2006,92(2):105-108.

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Detection of Chinese Sacbrood Virus in Drone Semen and Worker Bees ofApiscerana

SONG Wen-fei,YANG Shuang,MIAO Chun-hui,LIANG Cheng,ZHANG Xue-wen

(InstituteofSericultrueandApiculture,YunnanAcademyofAgricultrualSciences,Mengzi，Yunnan，661101，China)

In order to understand the infection of Chinese sacbrood virus(CSBV )in drones semen and worker bees ofApisceranaand seek indirect evidence for venereal transmission of CSBV in the same colony, CSBV in drone semen and worker bees were detected by RT-PCR in Mengzi of Yunnan.The results showed that CSBV were detected both in drone semen and worker bees, and there was a positive correlation between the infection of CSBV in drone semen and worker bees, the average infection rate of the drone semen was 93.33%. The results indicated that drone semen was CSBV carrier, which provided indirect evidence for venereal transmission of CSBV.

Chinese sacbrood virus; drone; semen; worker bee; RT-PCR

2016-07-01

国家现代农业产业技术体系(蜜蜂)“红河综合试验站”(CARS-45-SYZ 17 )；云南省农业科学院基础性超前预研项目( 2014CZJC014 )

宋文菲(1983-)，女，吉林蛟河人，助理研究员，硕士，主要从事蜜蜂病害防治及良种选育研究。*通讯作者

S855.3

A

1007-5038(2017)02-0064-04