非水相酶催化合成D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯的工艺研究

赵红霞，王应强，崔凤杰，刘爱青

(1.陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；3.北京盛美诺生物技术有限公司，100000)

非水相酶催化合成D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯的工艺研究

赵红霞1，王应强1，崔凤杰2，刘爱青3

(1.陇东学院农林科技学院，甘肃庆阳745000；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；3.北京盛美诺生物技术有限公司，100000)

以D-异抗坏血酸(EA)和硬脂酸为原料，利用单因素试验和正交试验，研究脂肪酶的种类、有机溶剂、酶量、温度、底物浓度和分子筛的用量对酶促酯化反应合成D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯(D-IS)的影响，并确定了其最佳反应条件。结果表明，在以叔丁醇为反应介质，固定化脂肪酶Novozym 435为催化剂的反应体系中，合成D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯的最佳反应条件为：底物摩尔比(EA：硬脂酸)为1∶4，温度为50℃，酶用量为20%，分子筛浓度为80g/L，摇床转速200rpm，反应24h后产物D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯的转化率为72.58%。

非水相；D-异抗坏血-6-酸硬脂酸酯；脂肪酶；正交试验

D-异抗坏血酸(Erythorbic Acid,EA)是L-抗坏血酸(维生素C)的光学异构体，是一种水溶性的、性能优良的食品抗氧化剂。与维生素C相似，其脂溶性很差，极大地限制了其在油脂类食品和化妆品中的应用[1]。开发脂溶性更强、稳定性更高的D-异抗坏血酸衍生物，有利于拓展D-异抗坏血酸的应用范围。D-异抗坏血酸高级脂肪酸酯是D-异抗坏血酸分子C-6上的伯醇羟基发生酯化反应时生成的，它不仅保持了D-异抗坏血酸的抗氧化活性，而且使动物和植物油中的溶解性和稳定性得以显著提高，是目前研究的热点[2-3]。

与L-抗坏血酸酯化衍生物的合成类似，D-异抗坏血酸的酯化反应可以采用酶法或化学法。目前工业化生产中采用浓硫酸催化的化学方法，该法易产生副反应、腐蚀性强、分离难度高且易造成二次污染。酶法合成因具有选择性高、反应条件温和及产品下游分离操作简单等优势而备受关注[4-6]。

本试验采用固定化脂肪酶Novozym 435为催化剂，催化D—异抗坏血酸分子C-6上的伯醇羟基与硬脂酸上的羧基发生直接酯化，得到具有两性结构的D-异抗坏血酸-6-硬脂酸酯，并对其合成的条件进行了优化，以期得到最大转化率。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

脂肪酶：Novozym 435、Lipozyme TLIM和Lipozyme RMIM，均购于北京诺维信生物有限公司；LVK-H100，LBK-B400脂肪酶均由深圳绿维康生物有限公司赠送。

D-异抗坏血酸(99%纯)，江西德兴百勤异VC钠有限公司赠送；4Å分子筛及硬脂酸、正己烷、甲醇、叔戊醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

RE-52AT旋转蒸发仪来自上海亚荣生化仪器有限公司；AL204型电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪(二元泵)日本SHIMADZU公司；101-2A电热恒温鼓风干燥箱金坛市鑫鑫试验仪器厂；XL-1马弗炉上海跃进医疗器械厂；YZG-600真空干燥箱金坛市医疗仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂脱水

所有用到的有机溶剂在使用前都需进行脱水处理。具体方法为：有机溶剂中加入已活化好的4Å分子筛于250ml带塞磨口锥形瓶中，室温下震荡(150rpm)48h后，滤去分子筛，得脱水有机溶剂。其中，分子筛的活化方法为：4Å分子筛在250℃的马弗炉中烘烤2小时后于干燥器中冷却待用。

1.3.2 酶法合成

参照Lindomar[7]等报道的合成方法，在50ml的具塞三角瓶中加入2.5mmol异抗坏血酸和10mmol硬脂酸，150mg脂肪酶，1g分子筛和20ml已脱水叔丁醇，而后置于电热恒温摇床振荡器中，在温度为50℃，转速为200rpm条件下反应48h。反应方程式如下：

(n=14)

1.3.3 分离纯化

采用0.45μm滤膜过滤反应液，除去脂肪酶和分子筛，滤液经旋转蒸发去除溶剂叔戊醇；乙酸乙酯溶解得到的干燥混合物，等体积的去离子水洗涤分出乙酸乙酯相，40℃下旋转蒸发除去乙酸乙酯，残余物用温热(约50～60℃)正己烷洗涤三次，所得不溶物在50℃下真空干燥2h，得到白色的粉末状物。

1.4 HPLC法测定产物转化率的条件及方法

分离纯化后的纯品通过在200～1000nm的紫外分光光度计进行吸收扫描，发现在254nm的波长下，D-异抗坏血酸和D-异抗坏血酸硬脂酸酯都有特征吸收，将配制好的一系列浓度的D-异抗坏血酸硬脂酸酯标准品溶液，在相同条件下，利用HPLC测定其色谱峰面积，根据浓度对色谱峰面积做标准曲线图。其中HPLC条件：日本岛津的LC-20AT；色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)，紫外检测器，流动相：甲醇∶水=75∶25(体积比)，流速：1ml/min，柱温：35℃，检测波长：254nm，进样量：20μl，分析时间：15min。

采用外标法定量分析，利用标准曲线计算D-IS的产量，转化率为：

1.5 数据处理

所有试验均重复3次，试验结果采用EXCEL统计分析软件处理，结果以平均值±标准误差(X±SD)表示。

2 结果与讨论

2.1 固定化酶催化酯化反应的单因素试验

2.1.1 脂肪酶种类对转化率的影响

脂肪酶(Lipases(E.C.3.1.1.3))是一类催化油脂水解的酯键水解酶[8,9]。不同的脂肪酶具有不同的结构，包括盖子区结构，这会影响它们的催化活性、区域选择性和立体选择性。本试验对不同来源的脂肪酶进行了筛选，结果如表1所示。结果表明，固定化脂肪酶Novozym 435表现出最高的催化效率，D-IS的转化率达到最大(33.3%)，这与我们之前研究D-异抗坏血酸棕榈酸酯(IP)的报道一致[10,11]。Lipozyme TLIM和Lipozyme RMIM也表现出了一定的催化活性，转化率分别为5.3%和11.9%。脂肪酶LVK-H100和LBK-B400没有表现出催化活性。因此，综合考虑，决定选取来源于Candidaantarctica的脂肪酶Novozym 435作为整个酯化反应的催化剂。

2.1.2 溶剂对转化率的影响

酶在非水溶剂中的活性与溶剂的极性有很大的关系。有机溶剂的疏水性可以通过改变蛋白质的三维构象而影响脂肪酶的催化活性[12]。Laane用有机溶剂的极性参数LogP来描述有机溶剂对酶催化反应的影响。有研究认为，LogP<2的有机溶剂不适合作为非水相酶促反应介质，是因为它将破坏酶的必需水化层，从而使酶失活[13]。从表2可以看出，本试验结果并不完全遵循上述规律。在叔丁醇(LogP=0.8)中转化率最高为47.9%，其次为叔戊醇(LogP=1.31)转化率为39.3%，这可能是由于有机溶剂的极性增强，使EA的溶解度增大，同时也增加了与脂肪酶的接触机会。其余的有机溶剂中没有产物生成。因此选叔丁醇为最适有机溶剂。

表1 脂肪酶的种类对合成D-IS的影响

(a：PLU：每1克酶生成的月桂酸丙酯的单位。b:Interesterification Unit(IUN)：国际单位，基于三丁酸甘油酯化试验。c:Batch Acidolsis Units Novo(BAUN)：高油酸含量的葵花籽油与癸烯酸在70-80oC下反应60min时的酶活力)

表2 有机溶剂对合成D-IS的影响

2.1.3 酶量对转化率的影响

酶催化反应的速度与酶浓度直接相关。较高的酶量可以提高酶催化酯化反应、酸解及酰基的迁移的效率。本试验取脂肪酶Novozym 435的量分别为底物和的1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%，以不添加Novozym 435作为对照，结果如图1所示。当酶添加量为0时，无D-异抗坏血酸硬脂酸酯生成。当酶量为20%时，产物转化率达到最大值(48%)，继续增大酶浓度，产物的转化率略有下降。这可能是随着酶浓度的增加，尤其是在有机溶剂中，反应介质的粘性增强，进而导致底物向内部的大部分酶颗粒的活性中心转移的效率下降，相似的结果Sun[10]等人也报道了。综合考虑，选取20%的酶量为合成D-IS的最适酶量。

图1 脂肪酶量(%)对D-IS转化率的影响

2.1.4 温度对转化率的影响

反应温度也是影响酶的活性和稳定性的重要因素[11]。在大多数情况下，随着反应温度的升高，反应速率也提高，但是酶的稳定性会降低。另外，当温度升高到一定程度时，酶会失去活性。因此为了研究反应温度对脂肪酶催化合成D-异抗坏血酸硬脂酸酯(D-IS)的影响，我们选取了从30～65℃的温度对其进行考察。

由图2可以看出，温度明显地影响产物的转化率(P<0.01)，从30℃开始升温，转化率随着温度的升高而上升；当温度上升到50℃时，转化率达到最高值55.8%，表明50℃时酶的催化活性最强；然而随着温度的继续升高，转化率反而下降，这可能是由于当温度超过酶的最适温度时，酶的活性构象受高温的破坏，而使其催化活性下降，因此，选取50℃作为Novozym 435催化合成D-IS的最佳反应温度。

图2 温度对D-IS转化率的影响

2.1.5 底物摩尔比对转化率的影响

在L-抗坏血酸脂肪酸酯的研究中，提高酰基供体的浓度还可以提高酶的催化稳定性。本试验在叔丁醇体系中，通过控制EA的量恒定，使底物摩尔比(EA和棕榈酸的摩尔比)由1增加到6，考察底物摩尔比对转化率的影响。从图3看出，随着底物摩尔比的增加，产物的转化率也随之增加。当底物摩尔比达到1∶4时，转化率达到最大值63.8%，此时酶已被底物饱和；如继续增加底物摩尔比，转化率降低。因此，选取底物摩尔比为1∶4为合成D-IS的最佳摩尔比。

图3 底物摩尔比对D-IS转化率的影响

2.1.6 反应时间对转化率的影响

为最高效地合成IP，对酶催化反应的最适时间进行研究，结果如图4所示，即随着反应时间的逐渐增加，产物的转化率也急剧增加，当反应进行到24h时，转化率达到66%，而时间从24h增加到36h转化率提高不明显，说明24h时酯化反应已经趋于平衡。因此，综合考虑，下一步反应选取24h为最适反应时间。

2.1.7 分子筛用量对转化率的影响

酶催化反应过程需要少量的水分来保证酶的最优构象和最优活性，但反应体系中过高的水分活度会降低反应速率，并加速水解反应。随着催化反应的进行，体系中的水分活度不断变化，因此利用渗透蒸发或微波辐射去除水分是必须的[14]。另外，加入去湿剂，如分子筛，因其较低的价格和易分离的特点，目前也是常用去除水分的方法。分子筛不仅能干燥反应介质和底物，而且还可以通过改变反应平衡吸附过程中形成的水分[15]。

本试验选取添加量分别为20、40、60、80、100g/L 4Å分子筛，以不加分子筛为对照，考察分子筛的用量对产物转化率的影响，结果如图5所示。当没有加入分子筛时，转化率最低，仅为8.64%；当浓度增加到40g/L时，转化率达到最大，为68.31%。随着分子筛浓度的继续增加，转化率逐渐下降，这可能是由于过量的分子筛导致体系中水分活度偏低，从而降低了酶的催化效率[15]。

图5 分子筛浓度对D-IS转化率的影响

2.2 正交试验优化

结合单因素试验结果，以D-IS的转化率为指标，选用四因素三水平L9(34)正交表进行D-IS合成条件的进一步优化，并进行方差分析。所考察的因素和水平如表3，试验方案及分析结果如表4。

表3 正交试验因素水平表

表4 正交试验设计及其结果分析

极差分析结果表明，四因素对D-IS转化率的影响程度依次为D(摩尔比)>B(温度)>A(酶量)>C(分子筛浓度)，理论最优方案为A3B2C3D2，即底物摩尔比为1∶4，温度为50℃，酶用量为20%，分子筛浓度为80g/L。方差分析结果如表5所示，结果显示试验决定系数R2为0.969，表明试验数据与可信度是很高的，可以用于预测产物的转化率。其中，摩尔比的影响最显著(P<0.05)。经验证试验发现，其转化率为72.58%，高于No.2试验值72.10%，因此最优方案参数更可靠。

表5 L9(3)4正交试验的方差分析

3 结果与讨论

试验研究了非水相条件下脂肪酶催化合成D-IS的影响因素。结果表明，在试验的5种脂肪酶中固定化酶Novozyme 435催化合成的D-IS转化率最高；有机溶剂可以改善底物的溶解性，但其种类和极性影响酶的活性和产物的转化率，叔丁醇介质中D-异抗坏血酸硬脂酸酯转化率较高；反应过程中加入适量的吸水剂4A分子筛有利于D-IS合成反应。

正交试验设计优化得知，在以叔丁醇为反应介质，固定化脂肪酶Novozym 435为催化剂的反应体系中，合成D-IS的最佳工艺为：底物摩尔比(EA：硬脂酸)为1∶4，温度为50℃，酶用量为20%，分子筛浓度为80g/L，此条件下产物D-IS的转化率为72.58%，这为D—异抗坏血酸硬脂酸酯的合成提供了一定的理论基础，但是要实现过程化产业还需要设计合适的连续化反应装置，并对反应装置进行放大，进而深入研究较大规模下脂肪酶催化合成D-异抗坏血酸硬脂酸酯的过程。

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【责任编辑 赵建萍】

Lipase-catalyzed Synthesis of D-isoascorbyl -6-Stearate in Nonaqueous Phase

ZHAO Hong-xia1, WANG Ying-qiang1, CUI Feng-jie2, LIU Ai-qing3

(1.CollegeofAgricultureandForestry,LongdongUniversity,Qingyang745000,Gansu; 2.SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 3.BeijingSEMNLBiotechnologyCo.,Ltd,Beijing, 100000)

One-factor-at-a-time and orthobonal array design methods are employed to study the esterification conditions, such as the kinds of lipases, organic solvent, enzyme load, temperature, substrate molar ratio and the addition of molecular sieves for lipase catalyzed of D-isoascorbyl Stearate(D-IS) from D-isoascorbic acid and Stearate acid. The result shows that 72.58% of conversion rate was finally obtained under the optimized condition:isoascorbic-to-Stearate acid molar ratio of 1:4, reaction temperature of 50oC, enzyme load of 20% (w/w) when the reaction parameters are set as:80 g/L of molecular sieves content, 200 rpm speed for 24-h reaction time in tert-butyl alcohol.

nonaqueous phase; D-isoascorbyl Stearate; lipase; orthogonal test

1674-1730(2017)01-0057-05

2016-03-22

国家自然基金《基于微波真空干燥技术的苹果脱水行为与品质调控研究》(31460398)；陇原青年创新人才扶持计划项目《基于微波加热的食品高效脱水平台建设及在陇东特色农产品加工中的应用》(75)；陇东学院博士科研启动基金《基于微波加热的食品高效脱水平台建设及在陇东特色农产品加工中的应用》(XYBY11)

赵红霞(1987—)，女，甘肃白银人，助教，硕士，主要从事食品加工与生物技术研究。

TS201.2

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