氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV的影响

方金龙，王 元，李新苍，周俊芳，陈甜甜，房文红

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV的影响

方金龙1，2，王 元1，李新苍1，周俊芳1，陈甜甜1，2，房文红1

（1.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部东海与远洋渔业资源开发利用重点实验室，上海 200090；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306）

为了评价养殖水环境中氨氮和亚硝基氮对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的危害性，开展了氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾感染WSSV后的死亡率、WSSV在患病对虾体内增殖速率和对虾主要免疫相关酶活性影响的研究。实验设置氨氮（NH4＋）和亚硝基氮（NO2－）的共同胁迫浓度均为20 mg·L－1，分别注射10－4和10－5稀释度的WSSV提取液。结果显示，胁迫下感染10－4WSSV的凡纳滨对虾144 h死亡率达到100%，显著高于无胁迫组（76.67%），相同实验条件下高浓度病毒感染组死亡率高于低浓度组。对虾鳃组织WSSV荧光定量PCR检测结果显示，氨氮和亚硝基氮共同胁迫下凡纳滨对虾体内WSSV的增殖加快，感染48 h后胁迫组病毒量是无胁迫组的1.6倍，72 h时病毒量达到无胁迫组的2.0～3.7倍。此外，免疫相关酶活性结果显示，氨氮和亚硝基氮浓度突变会促使对虾血清中酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）活性先短暂升高然后降低。由此可见，氨氮和亚硝基氮共同胁迫会加快WSSV在患病凡纳滨对虾体内的增殖，导致更高死亡率，这可能是因为胁迫造成了对虾免疫相关酶活性的降低和抗病原感染能力下降所致。

凡纳滨对虾；白斑综合征病毒；氨氮；亚硝基氮；胁迫

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）因为生长速度快、产量高、适应性强等特点而成为全球重要的水产养殖品种之一［1］。上世纪90年代初，凡纳滨对虾开始在我国养殖，现在已经是我国对虾养殖面积最大的品种。然而，随着我国集约化水产养殖迅速发展，养殖水体富营养化日益严重，其中氨氮、亚硝基氮等水质因子已成为影响对虾健康和生长的主要因素之一，在养殖环境胁迫下水产病害频发［2－3］。白斑综合征是危害养殖对虾重要疾病之一，凡纳滨对虾白斑综合征病毒（WSSV）携带率在30%以上，在养殖环境条件恶化时极易导致该病的爆发流行。有研究表明，环境因素如温度、盐度、pH、水温、氨氮和亚硝基氮等对凡纳滨对虾健康影响显著，环境的胁迫促使病害爆发［4－7］。甲壳动物体液中不具有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的免疫反应来自我保护，其免疫反应主要依靠吞噬细胞和体液中抗氧化酶活因子来抵抗病原菌的入侵［8］。在对虾体液因子中，酚氧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶等的活性常被用来反映对虾的免疫力［8］。本实验探究氨氮和亚硝基氮共同胁迫对感染WSSV凡纳滨对虾的发病死亡情况和病毒增殖情况，以及胁迫环境对凡纳滨对虾体液免疫相关因子活性影响，以揭示养殖环境与对虾健康和病毒增殖的关系，为凡纳滨对虾病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

凡纳滨对虾为东海水产研究所福鼎研究中心土池养殖，氨氮和亚硝基氮共同胁迫感染WSSV实验用虾的体质量为（7.5±0.5）g，共同胁迫对免疫相关酶活影响实验用虾体质量为（10.0 ±1.0）g。对虾从土塘捕捞后在实验室暂养适应一周后开始实验。实验海水盐度为24，水温为（25±1）℃，pH 7.9～8.1，24 h曝气。每天换一半的水，正常投喂商品颗粒饲料。

1.2 试剂与仪器

氯化铵、亚硝酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；左旋多巴购自SIGMA-ALDRICH；SYBR Premix Ex Taq TM等购自TaKaRa公司；基因组DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；0.22μm滤膜购自苏州赛恩斯仪器有限公司，超微量微孔板分光光度计（Epoch）购自BioTek公司；便携式水质检测仪（Octadem）购自无锡奥克丹生物科技有限公司；实时荧光定量PCR仪（StepOne Plus）购自ABI公司。

1.3 WSSV粗提液的制备

参照周俊芳等［9］方法，取感染WSSV死亡的凡纳滨对虾，去甲壳，剪取腹部肌肉，按质量体积比1∶9加入预冷PBS（pH 7.4），于玻璃匀浆器中冰浴环境充分匀浆，将匀浆液先经8层纱布过滤，再经过0.22μm滤膜过滤，取滤液作为WSSV粗提液，混匀后分装到离心管中－40℃冷冻保存备用。

1.4 氨氮和亚硝基氮共同胁迫下WSSV对凡纳滨对虾的致死实验

经预实验确定对虾攻毒的WSSV粗提液稀释度为10－4和10－5。

实验共设6组，分别为无胁迫下注射PBS（无胁迫PBS组）、注射10－5稀释度WSSV（无胁迫10－5组）、注射10－4稀释度WSSV（无胁迫10－4组），20 mg·L－1氨氮（NH＋4）与20 mg·L－1亚硝基氮（NO－2）共同胁迫下注射PBS（胁迫PBS组））、注射10－5稀释度WSSV（胁迫10－5组）、注射10－4稀释度WSSV（胁迫10－4组），用1 mL注射器在每尾虾第一腹节注射25μL稀释后的WSSV粗提液，设置2个平行，每个平行30 ind虾，养于装有200 L海水玻璃钢桶中。实验过程中，每天检测实验水质中氨氮和亚硝基氮浓度，观察对虾死亡情况并记录。

1.5 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对WSSV在凡纳滨对虾鳃内增殖影响

实验分为4组，分别为无胁迫下10－4、10－5稀释度WSSV攻毒组和胁迫下10－4、10－5稀释度WSSV攻毒组，设置2个平行，每个平行30 ind虾，氨氮（NH＋4）和亚硝基氮（NO－2）共同胁迫浓度均为20 mg·L－1。实验中攻毒方法同1.4。在注射WSSV后48、72、96、120、144 h，每组每个平行各采3 ind虾，于－40℃冰箱中冷冻保存，用于WSSV定量检测。

取上述冻存对虾的鳃组织作为样品，采用TIANGEN公司海洋动物组织总DNA提取试剂盒提取样品总DNA，用引物VP28F／VP28R采用普通PCR法检测实验对虾是否感染WSSV［9］，2%琼脂糖凝胶电泳检测。模板稀释50倍后用VP28F／VP28R和β-actineF／β-actineR两对引物进行荧光定量PCR，检测引物参照表1，体系设定为20μL，反应程序参照SYBR Premix Ex Taq TM说明书。

表1 荧光定量PCR检测WSSV Vp28基因和β-actin基因所用引物Tab.1 Primers used for quantitative real-time PCR of WSSV Vp28 andβ-actin

1.6 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾免疫酶活性影响

氨氮和亚硝基氮共同胁迫对免疫酶活性影响实验分为浓度突变和逐渐升高2种方法进行。浓度突变胁迫实验是将对虾从正常养殖海水（NH＋4和NO－2浓度分别是0.13 mg·L－1和0.04 mg·L－1）中直接投到氨氮（NH＋4）和亚硝基氮（NO－2）浓度均为20 mg·L－1海水中；浓度逐渐升高胁迫实验为每6 h氨氮和亚硝基氮浓度均升高1 mg·L－1，到20 mg·L－1后维持不变。每组120 ind对虾，养殖在800 L玻璃钢桶内，每天换水一半，事先将换水调到相应的浓度。水中氨氮和亚硝基氮用高浓度NH4Cl和NaNO2溶液调配。实验过程中除采样外，对虾成活率为100%。实验开始后，每组在0、6、12、24、48、96、144 h各随机采集15 ind虾，每3 ind为一组，从对虾的腹部血窦处抽取血淋巴，于2 mL离心管中－40℃冷冻保存。

取出冷冻保存的对虾血淋巴，于4℃冰箱中解冻，5 000 r·min－1离心10 min，取上清，检测免疫相关酶的活性［11］。

PO活性检测方法参照ASHIDA［12］，以左旋多巴为底物，采用96孔板法。向96孔板中加入200μL磷酸缓冲液（pH 6.0，0.01 M），再加入10 μL血淋巴上清液，然后加入10μL左旋多巴（0.01 mol·L－1），立即混匀，于酶标仪中490 nm波长处测OD值变化，每2 min检测一次，共检测15次。以时间和OD值变化作曲线，求曲线变化率，以实验条件下，每分钟OD490增加0.001为一个酶活单位。

AKP、ACP活性检测使用南京建成生物工程研究所酶活检测试剂盒。

1.7 数据处理与分析

不同处理组之间和同组不同时间点之间的对虾死亡率、病毒增殖量、PO、ACP、AKP活性等差异的显著性分析采用SPSS 22处理；WSSV荧光定量数据处理采用2－ΔΔCt法。

2 结果与分析

2.1 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对感染WSSV凡纳滨对虾致死率影响

在胁迫和无胁迫下，注射PBS的对照组最高死亡率分别为16.7%和11.7%，没有出现大量死亡，存活对虾健康状况良好。WSSV感染组，对虾在攻毒36 h后即表现出反应迟钝、体色发红、身体透明度降低、身体失去平衡、在水面或贴着桶壁侧游、发病死亡的对虾甲壳易剥离、甲壳上有白色斑点等症状。注射相同稀释度病毒粗提液的对虾，胁迫组比无胁迫组症状更加明显。在胁迫和无胁迫下，不同处理组的对虾死亡情况见图1。注射病毒液后随时间延长死亡率升高，到144 h注射10－4、10－5胁迫组的死亡率分别达到100%和78.3%，而无胁迫组分别为76.7%和70%。从72 h开始，胁迫条件下注射相同稀释度WSSV感染组的死亡率显著高于无胁迫组（P＜0.05）。从48 h开始，相同条件下，注射10－4稀释度病毒液的对虾死亡率一直高于10－5浓度组，但差异不显著（P＞0.05）。

图1 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对感染WSSV凡纳滨对虾死亡率的影响Fig.1 Effect of ammonia and nitrite on mortalities of L.vannamei infected by WSSV

2.2 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对WSSV在凡纳滨对虾鳃内增殖的影响

无胁迫10－5、无胁迫10－4、胁迫10－5和胁迫10－44个组的对虾体内病毒增殖与时间的变化关系见图2。胁迫组的病毒增殖量随时间增加较快，在72 h即达到最高；无胁迫组病毒增殖量随时间增加较慢，无胁迫10－4组在96 h达到最高，无胁迫10－5组在120 h达到最高。48 h时，胁迫组和无胁迫组病毒量没有显著性差异（P＞0.05）；在72 h时，胁迫组病毒量显著高于48 h（P＜0.05），也是同时期无胁迫组病毒量的2.0～3.7倍（P＜0.05）。96 h各个试验组对虾病毒量差异不显著（P＞0.05）。

图2 氨氮和亚硝基氮胁迫下对WSSV在凡纳滨对虾体内增殖的影响Fig.2 Effect of stress of ammonia and nitrite on WSSV quantity of L.vannamei detected by quantitative real-time PCR

2.3 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾免疫酶活性影响

2.3.1 对酚氧化酶（PO）活性的影响

在氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，凡纳滨对虾血清PO活性表现出先升高后降低变化（图3）。突变组血清PO活性在6 h即达到最高，显著高于对照组和渐变组（P＜0.05），48 h后PO活性显著低于对照组（P＜0.05），144 h仅为对照组的一半。与突变组相比，渐变组血清PO活性升高较为缓慢，12 h时达到最高然后下降，48 h后与对照组接近（P＞0.05）。

图3 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾PO活性影响Fig.3 Effect of stress of ammonia and nitrite on PO activity of L.vannamei

2.3.2 对酸性磷酸酶（ACP）活性的影响

氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，突变组对虾血清ACP活性呈现逐渐升高趋势，24 h显著高于对照组和渐变组（P＜0.05），48 h达到最高，然后逐渐下降（图4）。而渐变组血清ACP活性在96 h和144 h时显著高于对照组（P＜0.05）。

2.3.3 对碱性磷酸酶（AKP）活性的影响

氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，对虾血清AKP活性变化见图5。在氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，凡纳滨对虾血清AKP活性表现出先升高后降低。突变组血清AKP活性在6 h即达到最高，显著高于对照组和渐变组（P＜0.05），48 h后AKP活性显著低于对照组（P＜0.05）。而渐变组血清AKP活性虽有升高趋势，但与对照组没有显著性差异（P＞0.05）。

图4 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾ACP活性的影响Fig.4 Effect of stress of ammonia and nitrite on ACP activity of L.vannamei

图5 氨氮和亚硝基氮共同胁迫对凡纳滨对虾AKP活性的影响Fig.5 Effect of ammonia and nitrite on AKP activity of L.vannamei

3 讨论

养殖水体环境的污染，严重影响了养殖动物的健康状况，降低了其抗病能力。养殖过程中的残饵和产生的排泄物经过细菌的分解产生的氨氮和亚硝酸盐，是目前高密度养殖模式面临的巨大挑战。氨氮电离产生的非离子氨由于不带有电荷，可以通过动物表皮渗入动物体内，对动物体内酶的催化作用和细胞膜的稳定性产生严重不良影响，并破坏排泄系统和渗透平衡［13］。养殖水体的氮循环在亚硝酸盐转化为硝酸盐这个程序比较慢，造成亚硝酸盐在水体的积累，随着养殖时间的推移，浓度越来越高，对水体动物毒性越来越大［14］。CHENG等［15］研究表明，当亚硝酸盐浓度高于0.36 mg·L－1和暴露时间长于6 h，对虾血淋巴pH、氧合血蓝蛋白和血蓝蛋白浓度开始降低，血淋巴氧合血蓝蛋白转为脱氧血蓝蛋白，从而降低了对氧的亲和力，导致机体输氧能力下降，使机体因缺氧产生损伤。

WSSV是迄今为止对全球对虾养殖业危害最为严重的一种病毒，具有宿主泛嗜性［16］。SUN等［17］研究发现，WSSV可以侵入对虾鳃、甲壳下结蹄组织、肝胰腺等组织，鳃是对虾体内WSSV复制比较快的一个组织，实时荧光定量法检测到WSSV在感染中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）30 h后，病毒粒子增加600倍。刘强等［18］研究发现，0.2μg·L－1毒死蜱胁迫下，凡纳滨对虾感染WSSV 72 h后鳃组织中病毒量是对照组的4倍。本实验中，20 mg·L－1氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，感染WSSV后48～72 h是病毒快速增殖期，72 h时胁迫组病毒量是对照组的2.0～3.7倍，和刘强等［18］的实验结果一致。

氨氮和亚硝基氮长期胁迫下会降低对虾免疫相关酶活性，增加了病害爆发的可能性。酚氧化酶是酚氧化酶原激活系统被病原激活时释放的产物，是节肢动物非特异性免疫系统的重要组成部分。PO能与酚氧化酶原系统被激活后释放的其它物质共同介导黑化作用、细胞黏附、包囊形成、血细胞迁移和吞噬等反应，最终消灭侵入异物［19］。孙舰军等［20］研究发现，2.5 mg·L－1氨氮胁迫中国明对虾20 d后，其血清和肌肉的PO活性降低19.1%。王玥等［21］研究发现，罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）在1 mg·L－1氨氮或者亚硝态氮环境胁迫下PO活性减弱，分别在第1天和第10天达到最小值，显著低于对照组。李永等［22］研究发现，氨氮浓度为29.9 mg·L－1时，PO活性先略有升高后降低。本实验中凡纳滨对虾在氨氮和亚硝酸盐共同胁迫下24 h后，血清酚氧化酶活性开始降低，和上述文献报道的结果基本一致。随着胁迫时间的延长，渐变胁迫组PO活性变化不明显，表明胁迫浓度缓慢变化时，对虾PO对氨氮和亚硝基氮的胁迫具有一定适应和调整能力。

在甲壳动物体内，ACP和AKP作为溶酶体重要组成部分，催化磷酸单酯的水解反应和磷酸基的转移反应，加速物质的摄取和转运，也是水解酶体系的一部分，参与血细胞的吞噬和包囊反应，破坏和消除侵入体内的异物，达到机体防御的功能［21，23］。管小娟［8］认为，ACP和AKP可以作为判断甲壳动物免疫能力的参考数据。本实验中，当水体氨氮和亚硝基氮浓度突然升高时，对虾血清ACP活性呈现逐渐升高趋势，而AKP活性在6 h达到最高，随后开始下降，96 h达到最低值，变化趋势与血清PO相一致。

综合分析血清PO等酶活、虾体内WSSV增殖和死亡率与胁迫时间的关系，在48 h时胁迫组PO和AKP活性处于下降阶段，此时的胁迫组对虾死亡率和体内WSSV增殖与对照组差异并不显著；然而，随着时间延长，PO和AKP活性继续下降，胁迫组对虾体内WSSV增殖迅速，72 h达到了最高值，此时对虾死亡开始大幅增多。由此可见，在氨氮和亚硝基氮共同胁迫下，对虾体内PO和AKP活性下降，对WSSV感染的抵抗能力也开始下降，从而导致WSSV在体内迅速增殖，最终对虾死亡率不断升高。

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Effects of WSSV on cultured Litopenaeus vannamei under both ammonia and nitrite stress

FANG Jin-long1，2，WANG Yuan1，LIXin-cang1，ZHOU Jun-fang1，CHEN Tian-tian1，2，FANG Wen-hong1
（1.Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation and Utilization of Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China）

In order to evaluate the harmfulness of ammonia and nitrite on white pacific shrimp，Litopenaeus vannamei，this study was conducted to determine the combined effects of ammonia and nitrite on the mortality of white pacific shrimp infected with WSSV，WSSV proliferation in diseased shrimp and the activity of immunity-related enzymes in serum.The experiment consisted of treatments infected with PBS，WSSV extract of 10－5and 10－4dilution under the joint stress of 20 mg·L－1ammonia（NH4＋）and 20 mg·L－1nitrite（NO2－），and there were relative groups without stress as control.The result showed that the mortality of the group with stress-10－4WSSV reached 100%at 144h，significantly higher than the control group of stress-free-WSSV10－4with 76.67%mortality.Treatments with higher concentration of WSSV infection had higher mortality than that with lower concentration of WSSV infection under the same condition.Meanwhile，the amount of WSSV determined by Real-time Relative PCR showed that the stress of ammonia and nitrite accelerated WSSV proliferation in shrimp gills.The WSSV quantity of stress group was 1.6 times that of stress-free group at 48h while it reached 2.0－3.7 times at 72h.In addition，immunity-related enzymes activity experiment showed that the activity of phenoloxidase（PO），acid phosphatase（ACP）and alkaline phosphatase（AKP）in shrimp serum elevated firstly and then declined with time prolonged under joint stress of ammonia and nitrite.This study indicates that synergy of ammonia and nitrite accelerates WSSV proliferation in WSSV-infected L.vannamei and causes higher mortality，because stress environment lowers the activity of immunity-related enzymes and the ability of anti-infection of shrimp.

Litopenaeus vannamei；white spot syndrome virus；ammonia；nitrite；stress

S 941

：A

1004－2490（2017）01－0085－07

2016－03－21

上海市虾类产业技术体系建设项目［沪农科产字（2014）第5号］；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字（2013）第6－4号）

方金龙（1989－），男，硕士研究生，研究方向水生动物疾病防治。E-mail：fangjlzt＠163.com

房文红，研究员。E-mail：fwenhong＠163.com