藤黄酸对人胃腺癌细胞BGC-823细胞端粒酶逆转录酶和AKt蛋白磷酸化表达的影响

许毅 黄新恩 陈森清 马国建 张晓梅 朱明 俞军

藤黄酸对人胃腺癌细胞BGC-823细胞端粒酶逆转录酶和AKt蛋白磷酸化表达的影响

许毅 黄新恩 陈森清 马国建 张晓梅 朱明 俞军

目的 探讨藤黄酸(GA)对人胃癌细胞BGC-823端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA、AKt蛋白磷酸化表达的影响。 方法 将处于对数生长期的BGC-823细胞制成细胞悬液,加入96孔酶标板内,加入不同浓度的GA孵育24、48、72 h后,收集细胞,采用MTT比色法测定半抑制浓度(IC50)值;分别采用聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫反应(ELISA)法检测端粒酶的活性和逆转录PCR(RT-PCR)法检测hTERT mRNA的表达;通过免疫共沉淀(IP)法获得hTERT与磷酸化AKt(p-AKt)蛋白的结合体,然后用Western blot法检测p-AKt蛋白表达的变化。 结果 GA可以明显抑制胃癌细胞BGC-823的端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,呈一定的时效、量效关系;进一步研究发现,GA能够抑制hTERT 和p-AKt蛋白的结合,且作用呈时间依赖性,进而影响p-AKt参与的hTERT的活化,从而完成对hTERT转录后的调控,抑制端粒酶的活性。 结论 GA可明显抑制胃癌细胞BGC-823端粒酶活性和hTERT的表达,GA对BGC-823细胞生长抑制的作用机制可能与GA影响p-AKt参与的hTERT的活化,从而完成对hTERT转录后的调控有关。

人胃癌细胞BGC-823; 藤黄酸; 端粒酶; 端粒酶逆转录酶; 磷酸化AKt

研究表明,大多数胃癌细胞中有端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)表达,但是其作用机制和调控机制尚不清楚。最新研究结果表明,磷酸化的AKt(p-AKt)能够与hTERT结合并活化hTERT,从而激活端粒酶的活性[1]。我们已有研究表明,在BGC-823细胞中,藤黄酸(GA)能够抑制hTERT和p-AKt的结合,从而抑制hTERT的活化,进而影响端粒酶全酶的活性。本研究旨在揭示GA参与胃癌细胞端粒酶活性调节的核心机制研究,为进一步探讨GA的抗肿瘤作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 药物 GA原料药,含量98%,为橙黄色结晶,中国药科大学天然药物化学教研室提供,使用前用1640培养液稀释成0.52、0.74、1.06、1.51、2.16、3.08、4.40、6.29 μmol/L。

1.2 瘤株 人胃癌BGC-823细胞株、人宫颈癌Hela细胞株(端粒酶活性检测阳性对照)由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10 %的小牛血清1640 (GIBCO)于37 ℃、5% CO2培养箱中培养传代。

1.3 试剂和仪器 端粒酶引物:Ts引物: 5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；Cx引物: 5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’;hTERT引物(5’-3’):上游CGGAAGAGTCTGGAGCAA 、下游GGATGAAGCGGAGTCTGGA;AKt,p-AKt蛋白一抗购自santa cruz公司,二抗及Actin一抗、二抗均购自Sigma公司;小牛血清:杭州四季青生物工程公司产品,经56 ℃水浴30 min灭活,-20 ℃保存;青霉素、链霉素:山东鲁抗医药股份有限公司产品,批号20000628;培养基:RPMI-1640培养粉(美国GIBCO公司),用三蒸水配制,添加10%小牛血清及青霉素、链霉素各100 μl/ml,无菌过滤,4 ℃备用。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自美国sigma公司; TriPure试剂盒、DNase-free RNase购自美国罗氏公司;逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) kit 购自日本 TaKaRa公司。PCR扩增仪为美国PE公司;酶标检测仪为美国Gene公司BioTech产品;低温冷冻高速离心机为日本HITACH公司。

1.4 实验方法

1.4.1 BGC-823细胞生长抑制率测定:将处于对数生长期的BGC-823细胞用0.02%EDTA消化,制成细胞悬液,以2×105/ml细胞浓度加入96孔酶标板内,每孔100 μl,设五复孔,置37 ℃ 5% CO2孵箱内培养24 h左右,分别给予0.52、0.74、1.06、1.51、2.16、3.08、4.40、6.29 μmol/L GA,终体积为100 μl/孔,对照组Hela细胞株加入相同体积的培养基。给药后孵育24、48、72 h,加入20 μl MTT,37 ℃孵育4 h后加入100 μl DMSO。BioTech酶标仪570 nm处检测OD值。抑制率计算公式如下[3]：

1.4.2 BGC-823细胞的端粒酶活性测定:提取端粒酶:收集加药半抑制浓度(IC50)、作用24、48、72 h后,细胞用洗涤缓冲液(10 nmol/L Heps-KOH,pH 7.5,1.5 mmol/L MgCl2,10 mmol/L KCl,1 mmol/L DTT)洗1次,离心后弃去洗液。加入200 μl裂解液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,1 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,5 mmol/L β-巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油)冰浴30 min,16 000 r/min,4 ℃,30 min,取上清,测定其蛋白浓度,-80 ℃保存待用。

PCR-TRAP扩增:取待测样品50 μg总蛋白,反应体积为20 μl。其中含TS,CX端粒酶引物和反应混合物,25 ℃,30 min,然后在PCR扩增仪上扩增,条件为:94 ℃,30 s,50 ℃,30 s,72 ℃,90 s,循环30次,再72 ℃延伸10 min。

产物杂交检测:取5 μl扩增产物,加入20 μl变性试剂,25 ℃孵育10 min,再加入225 μl杂交缓冲液,振荡混匀后取100 μl混合物加入已包被的微孔板的各孔中,37 ℃,300 r/min振荡2 h,弃去杂交液,用清洗缓冲液洗3次,加入抗-DIG-POD工作液100 μl, 25 ℃,30 min,再用清洗缓冲液洗5次,加入TMB底物溶液100 μl,20 min后再加入100 μl终止液终止反应,用酶标仪测定标本450 nm吸收值(参照波长为690 nm)判断吸光度结果,读数结果>0.02为阳性,阴性对照选择同时培养的细胞株加蒸馏水。

1.4.3 GA对BGC-823细胞hTERT mRNA表达水平的影响:按照Tripure Kit 说明书提取细胞中的总RNA。采用RT-PCR检测hTERT mRNA的表达: RT-PCR所用引物参照文献,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)为内对照。(1)hTERT引物:上游:5’CGGAGAGTGTCTCTGGAGCAA3’，下游:5’GATGAA-GCGGAGTCTGG3’(扩增产物145 p)；(2)GAPDH引物:上游5’CCATGGAGAAGGCTGGGG3’,下游:5’CAAAGTTTGACACGGATGACC3’(扩增产物408 bp)。 使用One-step RT-PCR System (TARKARA)在PE GeneAmp9600 Thermocycler上操作。反应总体积为50 μl(模板RNA 1 μg,RT/Taq mix 1 μl,上下游引物各0.24 μmol/L,dNTP 200 μmol/L)。RT-PCR程序:50 ℃,30 min(合成cDNA)及94 ℃,2 min;35个循环:94 ℃,30 s,56 ℃,45 s,72 ℃,90 s;最后72 ℃延伸5 min。取8 μl PCR产物,在2%的琼脂糖凝胶中电泳分离(以100 bp DNA ladder为分子量标准),EB染色后紫外成像。

1.4.4 GA对BGC-823细胞hTERT和AKt蛋白表达的影响:配制12%分离胶,5%浓缩胶,样品与2× loading buffer等体积混匀,98 ℃变性5 min,上样,每孔总蛋白量约为25 μg。80 V浓缩胶30 min,120 V分离胶,2 h;取下胶,按尺寸剪取合适大小的Whatmann滤纸及硝酸纤维素膜,上下各3层滤纸,中间为胶和膜,胶在负极,膜在阳极,用玻棒仔细赶除气泡,采用半干式转膜,恒流75 mA,转膜60 min;转膜结束后,对比预染Marker蓝色条带剪切,hTERT蛋白122 kD,actin蛋白43 kD;将剪切好的硝酸纤维素膜浸入立春红工作液中,染色2～5 min后,蒸馏水冲洗,观察转膜效率,用PBST洗去立春红条带;封闭:用封口机将各条膜置于自封袋中,封好三边,加入现配的10%脱脂奶粉(或0.1% Casein酪蛋白),500 μl/条,尽可能排除气泡。封闭袋口,平放于摇床上,37 ℃温育45 min至1 h;封闭结束后,弃封闭液,用少量PBST将残余奶粉漂洗干净,清洗3次,每次10 min;加一抗。一抗用PBST稀释至工作液浓度(1∶500),取热封袋,将硝酸纤维素膜装入,加入抗体工作液,1 ml/袋,封口机将各条膜封闭于自封袋中,尽可能排除气泡。37 ℃恒温摇床反应1 h后,置于4 ℃冰箱过夜;第2天剪开自封袋,废弃抗体,将条膜置于皿中用PBST清洗3次,10 min/次;用PBST稀释辣根过氧化酶标记的二抗至工作液浓度(1∶2000),1 ml/条,按前法封袋。37 ℃恒温摇床反应1 h;反应结束后剪开袋口,弃二抗,用PBST清洗3次,10 min/次, PBS清洗10 min。于Odyssey近红外荧光扫描仪扫描。

1.4.5 GA对BGC-823细胞AKt蛋白磷酸化和hTERT相互作用的研究:通过免疫沉淀(IP)法获得hTERT与p-AKt蛋白的结合体,总蛋白提取后按体积比(1∶5)加入含有琼脂糖小球篦子,混匀充分。每100 μg蛋白样品加入5 μl hTERT抗体,轻柔振摇,混悬均匀。4 ℃,80 r/min振摇过夜。4 ℃,4000 r/min离心2 min,废弃上清。沉淀用适量PBS清洗,轻柔混悬,4 ℃,80 r/min振摇10 min。4 ℃,4000 r/min离心2 min,废弃上清。重复以上步骤2～3次,最后一次尽可能吸尽上清,废弃。沉淀中加入30 μl 4× loading buffer,轻柔振摇,混悬均匀。4 ℃,12000 r/min离心10～20 min,将上清转移至新EP管。98 ℃变性5 min,-20 ℃保存备用。然后用Western blot法检测p-AKt蛋白表达的变化。

2 结果

2.1 GA对胃腺癌BGC-823细胞生长的抑制作用 采用MTT法,研究GA对体外培养人胃腺癌BGC-823细胞的生长抑制作用,绘制其生长抑制曲线,结果显示不同浓度的GA作用于BGC-823细胞0～72 h后,细胞呈不同程度的抑制作用,此抑制作用与药物浓度和作用时间呈一定的依赖关系。根据孙氏综合法(改进寇氏法)计算得到,药物作用48 h,GA对BGC-823细胞的IC50为(1.41±0.20)μmol/L,表明GA对人胃腺癌BGC-823细胞有明显的生长抑制作用，并呈现明显的量效关系。 见图1。

图1 GA对BGC-823细胞的抑制作用

2.2 端粒酶活性检测结果 釆用1～50 μg不同浓度的HELA细胞株进行端粒酶活性测定。其吸收值为0.2～3.5,而正常人血清均低于0.2,其结果满足试剂盒的技术要求。因此将待测标本的吸收值>0.2定为端粒酶活性表达阳性的域值。实验结果表明:加药处理24、48、72 h后,端粒酶活性逐渐降低。

2.3 hTERT mRNA检测结果 在2%的琼脂糖电泳后可以看到,相对于未加药蒸馏水对照组,GA给药组相对灰度值降低,且随着作用时间的延长降低幅度明显,72 h后在电泳图上无条带。见图2。

图2 GA抑制BGC-823细胞hTERT mRNA表达

2.4 GA对BGC-823细胞AKt蛋白及其磷酸化表达的影响 体外培养的BGC-823 细胞经IC50剂量[(1.41±0.20)μmol/L]的GA分别处理24、48、72 h后,随着药物作用时间的延长,p-AKt蛋白的表达未有明显变化,而p-AKt蛋白水平均有不同程度的下降,24 h仅有少量降低,而48 h和72 h 时表达受抑明显。见图3。

图3 GA对BGC-823细胞AKt蛋白和p-AKt蛋白表达的影响

2.5 GA对BGC-823细胞p-AKt蛋白和hTERT相互作用的研究 体外培养的BGC-823 细胞经IC50剂量的GA分别处理24、48、72 h后,细胞在非变性条件下被裂解,用蛋白质hTERT的抗体免疫沉淀hTERT,与hTERT在体内结合的p-AKt蛋白也被沉淀了下来,用抗p-AKt的抗体免疫印迹法检测p-AKt蛋白的表达,结果发现:GA能够抑制hTERT 和p-AKt蛋白的结合,且作用呈时间依赖性,进而影响p-AKt参与的hTERT的活化,从而完成对hTERT转录后的调控,抑制端粒酶的活性。见图4。

图4 GA抑制BGC-823细胞hTERT 和p-AKt蛋白的结合

3 讨论

藤黄具有消肿、化毒、止血、杀虫的功用,用于治疗痈疽肿毒,顽癣恶疮,损伤,出血,牙疮蛀齿等,在祖国医学上早有记载。近二三十年来发现,该药具有显著的抗肿瘤活性,引起了广泛的重视。植物来源的天然活性物质相较于化学合成药物有着明显的优势,GA在有效剂量范围内无明显不良反应，对机体造血及免疫系统亦无显著影响,这提示GA可能作用于肿瘤细胞内独特的靶点。

端粒酶是真核生物染色体末端的核蛋白结构,端粒的一个主要功能是标记截然不同于破裂DNA末端和利于染色体复制的线性染色体末端。端粒酶的激活与癌症高度相关,提示端粒酶、端粒和端粒维持间的互相影响是癌症衍变过程中至关重要的一步。人端粒酶主要由端粒酶RNA(hTR),端粒酶相关蛋白(TP1),hTERT三部分组成[2-3]。几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT基因,hTERT具有聚合酶的活性。在无细胞体系中混合人端粒酶RNA和hTERT即可表现出端粒酶活性。虽然前2种成分对端粒酶的活性都是必需的,但是它们表达方式是不同的,它们在端粒酶阳性的肿瘤组织和端粒酶阴性的正常组织中广泛表达,而hTERT仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞和永生化细胞中表达,且由于TERTs内逆转录酶(RT)区的残基突变导致端粒酶活性消失,说明hTERT是端粒酶活性的决定因素[4-5]。在本研究中,我们检测了GA对人胃腺癌BGC-823细胞端粒酶活性及其亚基表达的作用。实验结果表明,GA(IC50剂量)对体外培养的胃癌细胞端粒酶活性有明显抑制作用,加药24 h后端粒酶活性还能通过银染检测呈阳性,加药48 h时端粒酶活性即大幅下降,银染已无法检测出阳性条带,加药72 h后则端粒酶已基本无活性。对hTERT的研究表明,hTERT mRNA的表达与端粒酶全酶的活性一致,加药24 h(IC50剂量)亚基mRNA的表达尚且很高,而GA作用时间延长至48 h和72 h后,半定量RT-PCR的电泳图上已基本看不到条带,其灰度扫描相对值已降至15%以下(相对于未加药组)。

对于端粒酶全酶的活性而言,与hTERT的转录活性相比,翻译后的修饰也同样重要,hTERT的活性受蛋白激酶复合物的调节[6]。有文献报道,蛋白激酶B/AKt复合物与上调hTERT蛋白磷酸化密切相关[7]。Smith等[8]证明了在hTERT磷酸化824位点的丝氨酸残基能够被AKt磷酸化。我们也在BGC-823细胞中发现了这一现象。而GA能够显著抑制AKt的磷酸化,而不影响总AKt的变化,这就说明GA通过AKt通路下调hTERT的磷酸化，具有hTERT转录后的调节功能。包括AKt,蛋白激酶C(PKC)和一些丝氨酸/苏氨酸激酶也与hTERT的磷酸化有关[9]。接下来我们将展开对这些酶的研究,诸如PKC等,探索这些酶是否也参与了GA诱导的hTERT去磷酸化过程。

综上所述,GA诱导的端粒酶活性的抑制是一个多因素的过程。下调hTERT的转录活性和hTERT翻译后的修饰都参与到了端粒酶的抑制过程之中。我们认为GA对人胃腺癌BGC-823细胞hTERT启动子的转录活性具有直接特异性的抑制作用,该作用为GA抑制端粒酶全酶活性以及hTERT mRNA水平的基础,还通过AKt通路影响hTERT翻译后的修饰。尽管GA钝化AKt的具体过程仍然不清楚,但是我们的研究清楚地表明GA可以作为一个潜在的治疗药物,通过抑制端粒酶活性从而治疗包括胃腺癌在内的多种恶性肿瘤。

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Effect of gambogic acid on AKt and human telomerase reverse transcriptase (hTERT) in human gastric carcinoma BGC-823 cells

XUYi.

DepartmentofPharmacy,JiangsuHospitalofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210029,China;

HUANGXin-en,CHENSen-qing,MAGuo-jian,ZHANGXiao-mei,ZHUMing,YUJun.

TumorResearchCenter,JiangsuCancerHospital,Nanjing210009,China

Objective To explore the effect of Gambogic acid(GA) on p-AKt and human telomerase reverse transcriptace(hTERT) in human gambogic acidstric carcinoma cells. Methods To investigate the inhibitiny effects of GA on human grastric carcinoma cells BGC-823, we observed the cells treated with GA by invert-microscope. MTT assay was applied to study the growth inhibition of human grastric carcinoma cells BGC-823 in vitro. The activity of telomerase and the expression of hTERT were detected by PCR-ELISA and RT-PCR. Furthermore, the immunoprecipitation assay was used to detect the affinity of hTERT and p-AKt in BGC-823 induced by GA treatment. And then protein level of p-AKt was determined by western blot analysis. Results GA decreased the expression of telomerase activity and hTERT at time-dependent and concentration-dependent manner. Then, further investigation showed that the affinity of hTERT and p-AKt was inhibited by GA treatment via the down-regulation of p-AKt expression in significant time- and concentration- dependent manner. Then the activity of telomerase was inhibited. Conclusions These results show that GA can inhibit the proliferation of human grastric carcinona cells BGC-823. The mechanism may be that GA inhibits the posttranscriptional activation of hTERT in an p-AKt dependent manner in BGC-823 cells and finally, and affect the activity of telomerase.

gambogic acid; BGC-823; telomerase; human telomerase reverse transcriptase; p-AKt

江苏省科技厅资助项目(BK20161598)；南京市科技局资助项目(201605006)；江苏省肿瘤医院重点课题(ZK201603)

210029江苏省南京市，江苏省中医院药学部(许毅)；210009江苏省南京市，江苏省肿瘤医院科研科(黄新恩，陈森清，马国建，张晓梅，朱明，俞军)

俞军，Email：13901591757@163.com

R 735.2

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.02.006

2016-04-14)