基质金属蛋白酶-1基因多态性对汉族人群牙种植早期失败的影响

何世林,徐 鹏,白 石

(1.重庆市永川区妇幼保健院口腔科 402160；2.重庆医科大学附属口腔医院种植科 400015)

基质金属蛋白酶-1基因多态性对汉族人群牙种植早期失败的影响

何世林1,徐 鹏2△,白 石2

(1.重庆市永川区妇幼保健院口腔科 402160；2.重庆医科大学附属口腔医院种植科 400015)

目的 从遗传学的角度探讨基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因多态性是否与种植体早期失败有关。方法 采用病例对照的临床试验设计方法，将选取的53例不吸烟、无牙周炎的汉族种植患者根据有无种植体早期失败(1个月内)分为失败种植体组和成功种植体组；同时收集所有患者的静脉血提取DNA；采用聚合酶链式反应和限制性片段长度多态性方法对MMP-1-1607位点进行基因型的测定。结果 携带MMP-1-1607 基因型1G/2G杂合子的患者其种植体早期失败的发生率明显高于携带MMP-1-1607基因型1G/1G纯合子患者。多元Logistic回归分析结果显示：MMP-1-1607 1G/2G 基因型相对于MMP-1-1607 1G/1G基因型的比值比是13．894(P<0.05)。结论 MMP-1-1607 1G/2G 基因型和种植体早期失败有相关性。

牙种植体；基质金属蛋白酶1；遗传学研究；基因多态性

口腔种植失败主要分为早期和晚期(指承担咬合力以后)两类[1-2]。早期失败的主要原因一般是吸烟、年龄、系统疾病、骨的质量和数量、外科损伤和手术中感染[3-4]。而晚期失败主要原因是种植体周围炎和咬合力量过大[5]。种植失败的发生并不是平均分布的，主要发生在高危的人群，基因的表现型会影响骨结合，因此种植的失败和基因的表现相关[6]。

基因多态性是指在生物种群中，同时和经常出现两种或多种等位基因。一般基因多态性分3大类：DNA片段长度多态性，DNA重复序列多态性，单核苷酸多态性(SNP)。而单核苷酸多态性是最常见的一种，占多态性的90%。基质金属蛋白酶类(MMPs)有多种生理作用，能调节各种细胞的行为，如血管生成、细胞增殖、凋亡等。MMP-1是间质胶原酶中表达最为普遍的一种内源性肽酶，主要作用是降解坏死组织的胶原纤维[7]。正常情况下在组织中表达比较低，但在生长因子和炎症因子的刺激下，其表达会上调。有大量文献证明，MMPs参与了许多基质炎症的疾病。MMP-1基因启动子-1607位点插入一个鸟嘌呤G使序列由5-CGAT-3变为5-CGGAT-3，导致 1G/2G单核苷酸多态性。

某些遗传因素的存在能影响宿主对微生物的反应，自身的免疫应答反应能决定疾病的严重程度，因此宿主的易感性也是重要因素。有研究表明，在汉族人群中MMP-1基因启动子区-16071G/2G的基因多态性与牙周炎发生发展存在着相关性[8-9]。 种植体周围炎和牙周炎有相似性，但在炎症进展速度和细胞组成方面仍有差别[10]。研究表明MMP-1基因多态性对种植早期失败有影响。Santos等[7]在种植体失败的病例中发现，MMP-1-1607 2G等位基因可能与种植体失败有关。目前有关MMP-1基因多态性在汉族人群中对成功种植早期失败的影响，还少见相关报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2010年3月至2013年3月在重庆医科大学附属口腔医院种植科接受种植义齿修复的患者，共53例。其中，男31例，女22例，均为汉族。年龄21～62岁。患者的病史和临床检查包括：年龄、性别、民族、植入部位、骨质量、种植体类型(奥齿泰osstem和赛弗 xive)、术中有无穿孔、术后有无感染、邻牙牙周状况。系统病史：血液病史、牙周病家族史、高血压、心脏病、糖尿病、甲状腺病、消化道疾病、女性患者的月经状况。其中所有纳入患者均没有吸烟史和牙周炎。种植成功标准：排除患者初期种植体稳定性不足35N.cm的;口腔内植入奥齿泰osstem或赛弗xive，按1个月内未出现种植体松动、脱落(没有负载)；同时种植修复后一年正常行使功能。种植失败组26例，男18例，女8例。成功种植体组27例，男13例，女14例。

表1 不同基因型在两组中的分布[n(%)]

1.2 样本采集和DNA提取 种植手术前，抽取患者的静脉血，采用TIANamp Blood DNA Kit(中国Tiangen公司)提取基因组DNA。

1.3 基因多态性分析

1.3.1 PCR扩增MMP-1基因启动子区域 使用两对引物分别扩增MMP-1基因启动子区域，引物序列如下：引物MMP-1F，5′-GTT ATG CCA CTT AGA TGA GG-3′和引物MMP-1R，5′-TTC CTC CCC TTA TGG ATT CC-3′。 上述引物均由上海英俊生物技术有限公司合成。PCR反应体系终体积25μL，其中含10×PCR buffer 2.5μL，样本DNA 2μL(约50～100 ng)，LATaq DNA聚合酶(大连TaKaRa公司)1 U；dNTP、MgCl2终浓度分别为0.2、1.5 mmol/L，引物终浓度为0.24 μmol/L。PCR反应循环参数为：94 ℃预变性 5 min；94℃ 30 s，59℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循环32次；最后 72℃ 10 min。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶10 V/cm电泳10 min，确定扩增片段的特异性。

1.3.2 PCR扩增产物的纯化 利用虾碱性磷酸酶(SAP，1 U/μL，美国Promega公司)和核酸外切酶Ⅰ(ExoⅠ，5 U/μL，大连TaKaRa公司)纯化PCR扩增产物。在每5微升的PCR产物中分别加入SAP和ExoⅠ各0.75 μL，37℃ 30 min酶切反应，80 ℃ 15 min酶失活。

1.3.3 PCR纯化产物的直接测序 使用BigDye terminator v3.1 sequencing Kit(美国ABI公司)试剂进行双向测序反应,测序引物为上述的扩增引物MMP-1F、MMP-1R。采用乙醇/醋酸钠法纯化测序反应的扩增产物，然后在ABI 3130基因测序仪上检测分析结果。根据测序结果，判定MMP-1基因的基因型。

1.4 统计学处理 所有的分析均用SPSS11.5统计软件处理。两组比较采用的Fisher exact test；相关因素的相对危险度分析用Logistic回归分析；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 种植体周围炎组和成功种植体组基因型分布 种植体周围炎组中发现2G等位基因的比例明显高于成功种植体组。其中成功种植体组中1G/1G基因型为17位患者(占所有患者的比例为63%)，2G/2G基因型为9位患者(占比33%)。种植体周围炎组中1G/1G基因型为0位患者(占比0%)，2G/2G基因型为5位患者(占比14%)。

2.2 不同基因型在对照组和试验组中的分布 在种植失败组中出现1G/2G或者 2G/2G基因类型的概率是比较高。见表1。

2.3 相关因素多元Logistic回归分析 年龄、绝经与否、骨质是否4类3个影响因素的比值比分别为0.968、0.845、0.724，相应的P值为0.720、0.521、0.652。

3 讨 论

种植植入前备洞是一种潜在的骨损伤，从而机体对损伤会有炎症反应。不同细胞(如中性粒细胞，巨噬细胞，T、B淋巴细胞，角质形成细胞，内皮细胞，成纤维细胞，破骨细胞和成骨细胞等)的异常免疫应答，都可以破坏种植体周围骨组织。在炎症情况下，炎症细胞会释放出炎症信号因子。MMPs是一组含Zn+的能够降解细胞外间质的蛋白酶。MMP-1是间质胶原酶中表达最为广泛的一种内源性肽酶，主要作用是降解坏死组织的胶原纤维(主要是Ⅰ型胶原)，并促进组织重建[6]。正常情况下在组织中表达比较低，但在生长因子和炎症因子等内源性因素的刺激下，其表达会上调。因此，MMP-1在炎症情况下会对种植体周围组织造成破坏。特别是早期，种植体在初期机械稳定性下降的情况下，而骨结合没有完全形成。此时如果患者的MMP-1表达过多，将对种植体周围组织产生过多的破坏，导致种植体早期失败。同时MMP-1表达过多的患者即使种植体形成骨结合，也更容易患种植体周围炎[11]。

国内林映荷等[12]对白细胞介素(IL)-1的基因多态性和种植体周围炎的相关性进行了研究，发现IL-1β+3954基因型Ⅰ/Ⅱ杂合子和种植体周围炎的发病相关。但是研究均纳入了吸烟患者，由于长期吸烟者影响牙周健康和种植体的长期效果，故对研究结果有一定的影响。本研究所有纳入患者均为不吸烟患者，保证了研究的准确性。

Santos等[7]在巴西拉丁裔患者中，种植体失败的病例中发现2G等位基因的比例 (50%)明显高于对照组 (25%)。同时，MMP-1-519等位基因如果由A替换为G，则MMP-1的表达会增加。但研究发现该等位基因的替换对种植早期失败没有影响[10]。而本研究结果显示，在汉族人群中，失败种植体组中发现2G等位基因的比例 (60%)也明显高于成功种植体组(35%)，和Santos等[7]的结果一致。

种植体失败的原因一般和牙周病息息相关。毕竟种植体周围炎和牙周炎有相似的病理过程，而且种植体周围炎是种植体失败的重要原因[13]。通过基因多态性的筛查能确定种植可能失败的高风险人群，有助于适当的术前预防和方案选择，以此提高种植的成功率。但这种研究时间不长，国内外研究的病例数量都偏少。而且影响牙种植体的局部因素和全身因素较多，仍然缺乏更多的循证医学支持。因而还需要更多研究来证实MMP-1基因多态性在汉族人群中和种植体早期失败的相关性。

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The relationship between MMP-1 genetic polymorphisms and dental implant early failure in Chinese Han nationality

HeShilin1,XuPeng2△,BaiShi2

(1.DepartmentofStomatology,MaternalandChildHealthHospitalofYongchuanDistrict,Chongqing402160,China;2.DepartmentofImplantology,theAffiliatedStomatologyHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400015，China)

Objective To make clear the relationship between the genetic polymorphism of MMP-1 and implant early failure．Methods We conducted a case control study,53 cases patients (no smoking history and without periodontitis)who have underwent dental implant were divided into experimental group(with dental implant failure)and control group(with dental implant success)according to early failure of dental implant (within one month).DNA of 53 patients in Han nationality were extracted by using Chelex-100 method and polymorphisms of the mmp-1-1607 gene were detected by restriction fragment length polymorphism after polymerase chain reactions.Results Patients with MMP-1-1607(1G/2G)genotype exhibited a significantly higher occurrence of implant early failure than those with MMP-1-1607(1G/1G)gene type(P<0.05)．The OR of the 1G/2G versus the 1G/1G of the MMP-1-1607 genotype was 13．894(P<0．05).Conclusion MMP-1-1607(1G/2G)genotype is associated with implant early failure．

dental implants;matrix metalloproteinase 1;genetic research;polymorphism

何世林(1981-)，主治医生，本科，主要从事口腔全科的研究。△

，E-mail:244920288@qq.com。

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.019

R782.12

A

1671-8348(2017)05-0635-03

2016-06-21

2016-08-19)