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以单细胞拉曼光谱为基础的细胞乙醇应激

2017-03-01籍月彤

江苏农业科学 2017年2期
关键词:单细胞曼光谱拉曼

滕 琳, 籍月彤

(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心,山东青岛 266101;2.中国科学院大学,北京100049)

以单细胞拉曼光谱为基础的细胞乙醇应激

滕 琳1,2, 籍月彤1

(1.中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心,山东青岛 266101;2.中国科学院大学,北京100049)

生物乙醇被认为是一种清洁的可再生能源,然而同时也是一种潜在的环境污染物。虽然目前关于细胞乙醇应激的研究已经非常广泛,但是细胞为生命活动的基本单元,对单细胞层面的细胞应激研究是非常必要的,有助于深化人们对单细胞进化的认识,然而目前在单细胞尺度进行细胞应激反应研究的方法还是非常有限的。拟采用单细胞拉曼光谱技术,对细胞在不同浓度乙醇处理下进行指纹图谱的检测,获得其单细胞应激的表型性状。结果表明,在不同浓度乙醇处理30min的条件下,细胞可以非常灵敏地对外界刺激进行反应,主要表现在脂类、蛋白类拉曼谱峰的强度增强,以及表征核酸类物质的拉曼峰强度下降;同时,由于在不同浓度乙醇作用下细胞的不同反应,可以对细胞外环境中乙醇含量进行预测。由研究结果可见,细胞乙醇应激可以采用单细胞拉曼光谱进行检测,同时该技术还可以应用在对环境中存在的乙醇含量的预测方面。

乙醇刺激;单细胞拉曼光谱(SCRS);浓度预测

目前,我国的机动车总数已经达到几亿辆的级别,汽车尾气的排放对细颗粒物(PM2.5)的“贡献”被认为是一个不可忽视的因素。生物乙醇可以利用废弃的秸秆或木质纤维素进行生产,不与人争粮,被认为是一种清洁的可再生能源,可以与汽油混合使用,能够更好地利用烷烃,并且提供更高的燃烧热量[1]。然而,对于环境或环境微生物而言,生物乙醇也是一种潜在的污染物。人们在研究如何利用微生物高效生产乙醇的同时,对细胞的乙醇耐受性也进行了广泛的研究,涵盖基因组学、转录组学、蛋白质组学以及代谢物组学的各个领域,所涉及的生物对象包括大肠杆菌[2-3]、酵母[4]及其他产乙醇的梭菌[5],或整合生物加工(consolidated bioprocessing,简称CBP)发酵中的其他功能菌株等,如嗜热纤维梭菌[6],此外还有很多研究未在此一一列出。因此,本研究选择细胞对乙醇的应激具有广泛的研究基础。

鉴于单细胞研究在理解生物进化及生命的环境适应性方面的重要作用,单细胞拉曼光谱(SCRS)技术因无需标记、快速简便的特性已经日益得到广泛应用。最近发表的1篇关于单细胞拉曼光谱技术在细胞应激丁醇方面的研究[7]表明,拉曼光谱的数据与传统试验方法具有很高的相关性。但是关于细胞在单细胞水平的乙醇应激研究目前尚未见报道。本研究立足于单细胞拉曼光谱的可靠性和不拘泥于群体水平研究的特点,旨在通过研究细胞对于不同浓度乙醇刺激的不同反应,认识细胞应对外界环境中乙醇的代谢层面的变化,对于深刻理解细胞的乙醇应激,以及对外界环境中存在的乙醇的检测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

本试验以大肠杆菌作为研究对象,因大肠杆菌具有丰富的研究背景、结构简单、缺乏免疫性、遗传操作简单,对其进行乙醇的生产和耐受研究在广度和深度上都是其他任何微生物所不能替代的。同时,大肠杆菌被认为是刺激响应的敏感体,由于其生长速度快,容易受到外界环境的影响,因此可以作为检测污水污染程度的理想细胞[8]。

本试验采用的乙醇等药品为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯产品;碘化丙啶(PI)购自Sigma,色谱纯,纯度≥94.0%。

在细胞培养过程中须要注意的是活化过程的一致性。因为拉曼光谱测量的严格性,细胞要经过比较严格的活化过程:先将-80 ℃保种的大肠杆菌在LB平板上于37 ℃活化 16 h,然后将其转接入2mL玻璃试管中,于37 ℃培养12 h后,再转接入120 mL液体LB培养基中进行扩培,进行乙醇的刺激试验,试验中设置6个乙醇浓度(体积分数)梯度:0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%,分别处理细胞30 min。此外,细胞在高浓度乙醇中的活性检测通过传统的碘化丙啶染色的方法进行。

1.2 单细胞拉曼光谱的采集

受刺激的细胞在经过0.5 h乙醇刺激后,进行细胞收集,条件为5 200 r/min,2 min。用ddH2O轻轻吹打,洗涤3次后稀释数百倍(使细胞能够分散于视野中,以便进行单细胞拉曼光谱的采集);而后吸取1.5 μL稀释的细胞悬液置于CaF2平板上,自然风干后,立即采用强度100 mW、波长532 nm激光的拉曼系统进行信号采集,每个图谱采集时间10 s(照射于细胞上的激光光照度约为25 mW)。这部分的工作须要注意的事项:首先,细胞要尽量清洗干净,不能因用力过猛而使细胞破碎;其次,风干过程要尽量迅速,避免细胞过长时间暴露于干燥的环境中,导致细胞破裂死亡。

1.3 数据处理及分析方法

采集到的单细胞拉曼光谱的处理,主要包括拉曼光谱的数据前处理和多变量分析。采集数据的形式:每个乙醇刺激浓度下设置3个生物学平行,每个平行测量20个独立的细胞,采集到的单细胞拉曼光谱数据共为6×3×20(即360个单细胞拉曼光谱)。

1.3.1 数据前处理 将以上得到的单细胞拉曼光谱通过Labspec 5软件进行去除背景操作(在每个生物学平行中,背景都随机采集了3个,这里取其平均值)、Get Zero操作、基于面积的归一化处理操作,使获得的数据都进行归一化。

1.3.2 多变量数据分析 主要有主成分和线性判别分析(PC-LDA)、支持向量机分析(SVM)和相似性分析(ANOSIM)3种。主成分和线性判别分析是一种受监督的多变量分析方法,这种方法的应用能实现2个目的:(1)可直观显示各组别间有无明显差异,此处PC-LDA的功能与人们熟知的主成分分析(PCA)是一致的,都可以将其分值进行抽取、画图;(2)这种方法是一种受监督的方法,能够计算出2个组间差异的决定因素是什么,即差异的拉曼峰值是哪些。本试验中PC-LDA是在R 2.15.0版本中实现的。SVM分析包括2步:(1)通过训练数据集得到1个模型;(2)通过训练数据集构建的模型来对测试数据集进行预测。在第1步模型建立的时候有2个重要的参数:C、υ,这2个重要的参数都是由模型自动选择的,选择的标准是模型通过交叉检验后错误率最低时的参数选择。相似性分析基于距离矩阵分析,能够通过比较组内、组间差异来解释对照组和处理组之间的拉曼光谱的相似性大小。

1.4 试验设计与流程

本研究的总体策略如图1-A所示,研究的定位主要依托于单细胞拉曼技术,以细胞应对乙醇刺激为核心,基于乙醇浓度的变化,追踪细胞表现的变化,通过考察不同浓度乙醇作用下的细胞反应,不仅能够反映单细胞拉曼技术的灵敏度,还能对细胞外在乙醇浓度进行准确预测。

基于以上研究策略及“1.1”“1.2”“1.3”节中叙述的具体试验流程,绘制试验流程(图1-B)。

笔者设置了“1.1”节中的一系列乙醇浓度梯度对细胞进行刺激反应,这部分工作预期实现的目标是单细胞拉曼光谱的灵敏性。设置未对细胞生长造成抑制的乙醇浓度,如0.5%、1.0%,但结果表明,即使是低浓度的乙醇刺激,细胞也会发生微小的代谢水平的变化(图1-C)。

2 结果与分析

2.1 拉曼光谱表征的不同乙醇浓度下的细胞反应

笔者选择了1种在R语言中可实现的、有监督的、结合主成分分析的线性判别分析方法,来展示、区分和解析乙醇处理组的细胞可否与对照组细胞相区别,以及哪些关键的拉曼峰值对这种区别有贡献。首先,通过拉曼光谱的比较发现,在乙醇刺激下,细胞的拉曼光谱之间是有差异的(图2)。根据PC-LDA的结果(图3-A),笔者发现,对照组细胞与乙醇处理的细胞都依次在PC-LDA因子1的方向上区别开来;可是对于0.5%、1.0%乙醇处理的细胞,即在生长曲线上没有显著差异的乙醇处理下,在PC-LDA因子1的方向上与对照组细胞非常接近,几乎聚在一起,但在PC-LDA因子3的方向上这3组细胞可以很明显地区分开来;对于5.0%乙醇处理的细胞,在PC-LDA因子1的方向上与3.0%乙醇处理的细胞区分难度比较大,但在PC-LDA因子2的方向上的区分非常明显。无论在低浓度或是高浓度的乙醇作用下,单细胞拉曼光谱主要变化的峰值位置如图3-B所示,主要是表征核酸类物质的拉曼峰值(783、812、1 481、1 575 cm-1等)处的降低,在脂类(1 448 cm-1)、蛋白类(1 002 cm-1)物质处的拉曼峰值升高。说明细胞可能在应对乙醇刺激时,细胞膜有增厚的趋势,导致细胞中脂类明显升高。此外,细胞内核酸含量的减少,可能的原因是RNA的减少或是由于细胞体积增大而使得核酸呈现出稀释的作用,这是使表征核酸类物质的拉曼峰值降低的原因。

2.2 乙醇刺激下细胞的活性检测

用乙醇对细胞进行处理,从生长曲线角度来看,细胞生长变慢、细胞死亡也可能是细胞拉曼光谱发生变化的原因。因此,笔者主要对细胞在较高浓度乙醇(5.0%)处理下随时间变化的活性来表征。结果表明,1 h的乙醇刺激对细胞活性几乎没有影响。从1 h的对照组、刺激组的PI染色结果(图4-A)不难看出,在细胞死亡率方面,乙醇处理组的细胞并没有比对照组细胞的死亡率(百分之几的水平)明显提高,证明1 h内乙醇浓度为5.0%对于细胞活性没有明显伤害。当细胞经过5 h的乙醇处理时,细胞的死亡率略有升高,但总体来讲细胞致死率不是很高(图4-B)。本试验采用不同浓度的乙醇对细胞进行处理,大部分乙醇浓度低于5.0%,且本试验中所采用的刺激时间很短,为0.5 h,所以基本可以忽略细胞活性受到乙醇影响。因此可以得出,细胞拉曼光谱的变化确实是在乙醇作用下细胞代谢层面的生理变化。

2.3 基于单细胞拉曼光谱的乙醇浓度预测

采集用不同浓度乙醇处理后各细胞的拉曼光谱,用多变量分析方法能够对其进行区分。笔者采用SVM分析,将不同浓度乙醇处理下的单细胞拉曼光谱混在一起,并随机抽取15个细胞作为测试数据集,剩余的45个细胞作为训练数据集。最终结果表明,经过不同浓度乙醇处理的细胞都能够实现其各自组别90%以上的区分正确率(表1)。

此外,根据细胞的指纹光谱,比较乙醇处理组细胞与对照组细胞之间的差异,笔者采用相似性分析的方法(ANOSIM;基于Jensen-Shannon Divergence距离矩阵;permute=999)。这种相似性分析经常被应用于宏基因组分析中,但单细胞拉曼光谱由于其光谱峰值数量巨大而且不同组别含有大量不同的单个细胞等,很适合采用多变量方差分析的方法对拉曼数据进行分析,而相似性分析在计算处理组与对照组之间差异

表1 不同浓度乙醇刺激下细胞反应的区分和预测结果

注:Pearson相关R2= 0.96。SVM用于预测,ANOSIM用于区分。

方面有特长。结果表明,采用低浓度乙醇处理的细胞与对照组细胞之间存在较为微小的差异(R值越接近0,证明差异越小;越接近1,证明差异越大),但这种差异为极显著差异(P<0.01)。说明采用低浓度的乙醇处理细胞,细胞拉曼光谱有明显变化,但反应程度较小;而采用较高浓度的乙醇处理细胞,如体积分数为5.0%,细胞反应极显著而且剧烈(P<0.01;R=0.54)。同时,由相似性分析得到的细胞反应程度(R值)与乙醇浓度之间呈现很强的线性相关(皮尔森系数为0.96)。这说明,根据细胞在不同浓度乙醇中的单细胞拉曼光谱变化情况,可以对细胞外环境中乙醇浓度进行预测。与传统的乙醇试剂盒相比,这种方法不仅可以提供乙醇的浓度信息,还能提供细胞代谢层面的变化信息。

3 结论

目前在单细胞水平研究细胞的刺激反应的方法是非常有限的,本研究中介绍的单细胞拉曼技术结合显微操作技术,是一种非标记的、不依赖于群体细胞的研究,并且其独特的灵敏性使之具有更广阔的应用前景。在本研究中,以乙醇作为刺激物,通过设置一系列浓度的刺激,监测不同浓度乙醇处理下细胞的单细胞拉曼光谱变化,从而对细胞的反应进行表征。通过结合多变量分析,使得单细胞拉曼光谱表征的细胞刺激反应更具统计意义。但是,单细胞拉曼光谱表征细胞应激反应在精度上是有待提高的,不能精细地表征细胞内特定成分的变化,须要与其他方法联用。但本方法是一种新颖、独特、灵敏的检测细胞应激乙醇的代谢物反应,并且可以对胞外乙醇浓度进行有效地预测,同时对其他环境刺激物的监测也具有指导作用。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.073

2015-12-04

国家自然科学基金(编号:91231205)。

滕 琳(1985—),女,河北保定人,博士研究生,从事微生物遗传分析研究。E-mail:tenglin@qibebt.ac.cn。

籍月彤,硕士,副研究员,从事单细胞拉曼技术应用开发。E-mail:jiyt@qibebt.ac.cn。

Q256

A

1002-1302(2017)02-0262-03

滕 琳,籍月彤. 以单细胞拉曼光谱为基础的细胞乙醇应激[J]. 江苏农业科学,2017,45(2):262-264,284.

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