多种鱼类肌浆蛋白与过敏患者血清特异性IgE结合情况检测与分析

石径，罗永康*，江米足

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.浙江大学附属儿童医院，浙江 杭州 310001)

多种鱼类肌浆蛋白与过敏患者血清特异性IgE结合情况检测与分析

石径1，罗永康1*，江米足2

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；2.浙江大学附属儿童医院，浙江 杭州 310001)

收集浙江地区过敏性疾病患者血清80例，采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定7种鱼类肌浆蛋白与对鱼过敏和仅对虾蟹过敏两组过敏患者血清特异性IgE的结合能力。通过凝胶电泳和免疫印迹分析多种鱼类肌浆蛋白的蛋白质组成和过敏原分布情况。实验结果显示，鱼过敏和虾蟹过敏两组患者血清对每种鱼肌浆蛋白特异性IgE阳性率之间的比较无显著性差异，具有一定的一致性。过敏患者血清与不同种鱼类肌浆蛋白反应的阳性率有所差别，总体来看虹鳟(Oncorhynchusmykiss)阳性率最高(70.67%)，其次为大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(46.67%)和大口黑鲈(Micropterussalmoides)(26.39%)，鳙、鲤、草鱼和鲟的阳性率相对较低。电泳分析显示不同种鱼类的蛋白质组成存在一定差异。免疫印迹结果显示，不同品种鱼类与阳性血清反应的组分有所差异，而其中特异性反应阳性率较高的虹鳟、大菱鲆和大口黑鲈3种鱼在分子量12 kDa左右存在特异蛋白条带。本研究对鱼过敏和虾蟹过敏人群血清中多个品种鱼类的肌浆蛋白特异性IgE进行了全面的检测分析，对水产品过敏疾病的预防和低致敏性水产食品的开发，提供一定的理论依据。[中国渔业质量与标准，2017,7(1):22-28]

鱼蛋白过敏；特异性IgE；肌浆蛋白；过敏患者血清

食物过敏一直是备受关注的公共卫生问题，随着社会的进步和发展，食物过敏性疾病的发病率逐年增加，给人们的生命健康造成了巨大的威胁[1]。食物过敏是人体对食品中抗原物质产生的主要由免疫球蛋白E(IgE)介导的Ⅰ型超敏反应，临床上表现为荨麻疹、哮喘和腹泻等症状，严重可导致休克[2]。食物过敏性疾病主要通过体内皮肤点刺试验和体外血清特异性IgE检测等方法进行诊断[3]。在联合国粮农组织(FAO)提出的8大类容易引起过敏的食物中，鱼类是其中重要的种类，过敏发病率较高[4]。杨华等[5]对370例慢性荨麻疹患者的检测发现，食物性变应原阳性率最高的是淡水鱼(61.35%)，其次为海蟹(55.68%)、海鱼(37.84%)。

小清蛋白是鱼类最主要的过敏原蛋白，国外自1971年首次从鳕(Theragrachalcogramma)中发现小清蛋白后，在鱼类过敏方面做了许多的研究工作[6-8]。机体对小清蛋白不同表位产生不同的特异性IgE抗体，患者临床上可能对多种鱼类都产生过敏反应，也可能仅对某种鱼表现出过敏反应[9]。国际上对鱼类过敏的报道大多集中在海水鱼，国内起步较晚，目前对鱼类过敏原的研究正在逐渐深入[10-11]。目前的研究和报道已鉴定出多种鱼类过敏原，Li等[12]从草鱼(Ctenopharyngodonidellus)中纯化分离并鉴定出草鱼主要过敏原小清蛋白的3个亚型，分子量均在11 kDa左右。Guo等[8]从日本海鲷(Evynnisjaponica)白肉中发现除了小清蛋白，还有一种14 kDa的过敏原蛋白。Liu等[13]鉴定出淡水鱼团头鲂(Megalobramaamblycephala)中2种主要的过敏原蛋白，免疫印迹分析中与过敏血清的IgE表现出特异性结合，两种过敏原的分子量分别为47和41 kDa，经鉴定两个过敏原分别为烯醇酶的亚型和肌肉肌酸激酶。中国是鱼类特别是淡水鱼生产和消费大国，因食用鱼类而引起过敏的现象也时有发生。不同种鱼类在鱼过敏患者人群中的致敏率是否有差别，对其他水产品过敏的患者是否对鱼类产生交叉过敏反应，目前还鲜有报道。本研究以国内常见的鳙(Aristichthysnobilis)、鲤(Cyprinuscarpio)、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、鲟(Acipensersinensis)、大口黑鲈(Micropterussalmoides)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和大菱鲆(Scophthalmusmaximus)7种鱼类为研究对象，提取其肌浆蛋白，通过ELISA、SDS-PAGE和Western blot方法检测鱼类蛋白与鱼过敏患者血清特异性IgE的结合能力，分析和比较不同种鱼类蛋白的致敏能力。同时与鱼蛋白和仅对虾蟹过敏患者血清的特异性IgE结合能力进行差异性比较，分析对虾蟹过敏患者与鱼蛋白的交叉反应情况。为鱼类过敏的研究和低致敏性鱼类食品的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜的鳙、鲤、草鱼、鲟、大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆购买于北京小月河农贸市场，快速活体运至实验室，击毙，去鳞，取背部白色肉进行蛋白的提取。

过敏患者血清：收集浙江大学附属儿童医院经临床诊断为荨麻疹、哮喘、过敏性鼻炎等过敏性疾病，并在过敏原检验报告单中显示对鱼类过敏原检测为阳性(特异性IgE含量(0.35 IU/mL)的儿童患者血清共67例(血清编号分别为：1-52、1-75、1-76、1-79、1-80、1-81、1-84、1-97、1-110、1-116、1-121、1-126、1-130、1-138、1-163、1-163、1-165、1-167、1-170、1-175、1-176、1-182、1-191、2-9、2-11、2-13、2-15、2-17、2-22、2-26、2-29、2-32、2-48、2-56、2-57、2-59、2-60、2-61、2-68、2-71、2-75、2-82、2-90、2-94、2-96、2-100、2-101、2-104、2-107、2-116、2-126、2-129、2-132、2-134、2-145、2-147、2-151、2-154、2-167、2-169、2-174、2-181、2-186、2-187、2-188、2-196、2-197、2-198)，另收集仅对虾和蟹过敏原检测为阳性的患者血清13例(血清编号分别为：1-179、1-195、1-208、1-222、1-223、2-77、2-166、2-173、3-17、3-45、3-80、3-83、3-85)。过敏患者血清共计80例，其中男性50例，女性30例；年龄在6个月～12岁之间。

阴性血清：收集个人和家庭成员均无过敏性疾病的人的血清9例，其中男性5例，女性4例，阴性血清混合制成血清池，作为ELISA和Western blot检测中的阴性对照。血清分离后至检测前于-60 ℃保存。

试剂：辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgE抗体(Sigma)；蛋白质标准分子量；其他所用药品或试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 鱼肉肌浆蛋白的制备

取5 g绞碎的鱼肉，加入5倍体积冷的0.02 mol/L Tris-HCl，pH7.5的缓冲溶液，均质后，4 ℃静止30 min，10 000 g离心20 min，取上清液即为肌浆蛋白，双缩脲法测定其蛋白含量。1.2.2 鱼肌浆蛋白与过敏患者血清IgE结合能力的测定

采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定7种鱼肉肌浆蛋白与过敏患者血清IgE抗体的特异性结合能力。7种鱼肌浆蛋白的包被浓度为0.01 mg/mL，5倍稀释的鱼过敏和虾蟹过敏患者血清分别作为一抗，同时添加阴性血清作为对照。二抗为羊抗人IgE-HRP(Sigma)，稀释倍数500倍。利用酶标仪双波长测定各孔450和630 nm下的吸光值OD450和OD630，各孔吸光值记为OD=OD450-OD630。

鱼肉肌浆蛋白与过敏患者血清的结合能力通过吸光值高于阴性血清的百分比来表示，计算公式为：鱼蛋白与IgE结合能力(%)=(OD-OD0) /OD0×100。其中，OD为各患者血清ELISA法测定的吸光值；OD0为阴性血清对应的吸光值。ELISA反应呈阳性血清的筛选，以鱼蛋白与过敏患者血清IgE结合能力>100%为标准。

1.3 SDS-PAGE电泳

采用SDS-PAGE对7种鱼肌浆蛋白中的蛋白质组分进行分析。肌浆蛋白与电泳样品缓冲液1 ∶1(V/V)混合，沸水浴加热5 min，上样量为80 μg。电泳分离胶浓度10%，浓缩胶4%，初始电压80 V，至样品前沿刚好进入分离胶后，电压提高到120 V。

1.4 Western blot分析

将鱼过敏患者血清中ELISA检测显示至少对1种鱼蛋白呈阳性的血清混合制成阳性血清池，与7种鱼类鱼肌浆蛋白提取液进行Western blot，混合的阴性血清池作为阴性对照。鱼肌浆蛋白提取液经SDS-PAGE分离后，将凝胶根据蛋白分子量大小分为上、下两部分，200 mA恒流，大、小分子量凝胶转膜时间分别为90 min和15 min，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上。转膜结束后，用5%脱脂乳粉37 ℃封闭1 h，人血清用封闭液稀释10倍，4 ℃孵育过夜，TBST清洗5次(前两次5 min/次，后三次10 min/次)，二抗(HRP标记的羊抗人IgE，1 ∶10 000)37 ℃孵育1 h，TBST清洗5次，加入ECL化学发光液后，于暗室中将膜曝光于X光片上，显影、定影后扫描保存结果。

1.5 统计学分析

所有数据经Excel和SPSS 17.0软件进行检验，计量资料以平均数±标准差表示，两组间率(%)的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 鱼肌浆蛋白与过敏患者血清IgE结合能力的检测

采用ELISA法检测7种鱼肌浆蛋白与收集的过敏患者血清特异性IgE结合能力的结果如图1所示。总体来看，不同种类的鱼肌浆蛋白与过敏患者血清IgE的结合能力存在差别。虹鳟的肌浆蛋白与所检测的血清呈阳性反应的比例最高，阳性血清共53例(阳性率70.67%)，其次与大菱鲆和大口黑鲈两种鱼肌浆蛋白反应呈阳性的血清比例较高，血清阳性率分别为46.67%和26.39%。另外4种鱼类肌浆蛋白与血清反应的阳性率较低，从高到低分别为草鱼(16.00%)、鲤(8.00%)、鳙(5.33%)和鲟(2.67%)。

2.2 两组水产过敏患者血清检测阳性率比较

将水产过敏患者血清根据病例信息分为鱼过敏和虾蟹过敏两组，对两组血清中不同鱼蛋白特异性IgE检测阳性率及阳性例数的比较见表1。卡方检验结果显示，两组血清对不同种鱼类肌浆蛋白的特异性IgE阳性率不存在显著性差异，表明两组血清对每种鱼肌浆蛋白的特异性IgE阳性率有一定的一致性。整体而言，鱼过敏患者血清对不同鱼类蛋白的阳性率存在差异，阳性率在3.0%～71.6%之间；虾蟹过敏患者血清对鳙、草鱼和鲟3种鱼无阳性反应，对其他4种鱼的阳性率分布在12.5%～62.5%之间。两组血清阳性率最高的均为虹鳟，其次是大菱鲆和大口黑鲈。结果显示，在医院诊断为鱼过敏和虾蟹过敏的患者血清样本中，不同品种鱼类蛋白的特异性IgE阳性率存在差异，不同鱼类的致敏能力不同。仅对虾蟹过敏的患者血清对鳙、草鱼和鲟蛋白的交叉反应较弱，对其他4种鱼类蛋白存在不同程度的交叉反应。目前对过敏患者过敏原IgE的检测也有较多的相关研究，但对多个品种鱼类过敏原的检测和分析较少。戴海玲等[14]对患有荨麻疹及湿疹、哮喘和过敏性紫癜3组患儿血清中过敏原IgE进行的检测结果显示，水产品过敏原阳性率由高到低依次为：虾、蟹、海鱼组合和淡水鱼组合。李敏等[15]对南京地区患有哮喘、过敏性鼻炎和荨麻疹不同过敏性疾病的1 047名患儿血清进行过敏原检测的结果显示，患儿血清整体对鳕、龙虾、扇贝阳性率最高，达14.61%，其次为鲑(7.92%)、蟹(6.20%)和虾(4.87%)。

表1 两组水产过敏患者血清对多种鱼类蛋白特异性IgE检测阳性结果比较

2.3 鱼肌浆蛋白的SDS-PAGE分析

7种鱼肌浆蛋白的SDS-PAGE分析如图2所示。不同鱼类肌浆蛋白的电泳图谱存在一定的差异性，鳙、鲤和草鱼3种鱼肌浆蛋白的组成十分相似，其中草鱼在26～55 kDa分子量范围内的蛋白浓度相对较高，条带较深，这与3种鱼中草鱼的过敏患者血清阳性率相对较高具有一致性。鲟、大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆4种鱼的肌浆蛋白组成与前3种鱼的差别较大，在分子量10～17 kDa和分子量20～55 kDa的蛋白条带差异较明显，差异蛋白中可能存在一种或多种过敏原蛋白，从而导致大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆3种鱼肌浆蛋白与过敏患者血清反应的阳性率较高。目前的研究和报道已鉴定出多种鱼类过敏原，鱼类主要的过敏原蛋白小清蛋白分子量在12 kDa左右，Liu等[13]鉴定出淡水鱼团头鲂中2种主要的过敏原蛋白为烯醇酶的亚型和肌肉肌酸激酶，分子量分别为47和41 kDa。

图1 7种鱼肌浆蛋白与过敏患者血清特异性IgE的结合能力Fig.1 Specific IgE binding capacity of sarcoplasmic protein of seven kinds of fishes in serum of patients with aquatic allergy

图2 几种鱼肌浆蛋白的SDS-PAGE分析M: 标准蛋白；1: 鳙；2: 鲤；3: 草鱼；4: 鲟；5: 大口黑鲈；6: 虹鳟；7: 大菱鲆。下同。Fig.2 SDS-PAGE analysis of sarcoplasmic protein ofseveral kinds of fishesM:Standard protein; 1: Aristichthys nobilis; 2: Cyprinus carpio; 3: Ctenopharyngodon idellus; 4: Acipenser sinensis; 5: Micropterus salmoides; 6: Oncorhynchus mykiss; 7: Scophthalmus maximus. The same below.

2.4 Western blot对鱼蛋白过敏原的分析

鱼过敏患者阳性血清与阴性血清分别与7种鱼肌浆蛋白的western blot分析结果如图3所示。阴性血清也存在不同程度的结合条带，这可能是因为人血清相比制备抗体成分更复杂，因而存在非特异性结合。与阴性对照血清相比，7种鱼类肌浆蛋白与阳性过敏患者血清反应的蛋白组分有所差异，条带数量均明显多于阴性血清。特别对ELISA检测中与过敏患者血清结合阳性率较高的大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆3种鱼进行分析，与阴性血清对比可以看出这3种鱼类在分子量12 kDa左右和分子量20～50 kDa范围存在较多特异蛋白条带。其中12 kDa左右的特异条带为大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆3种鱼特有，另4种鱼中均未检测出，但大菱鲆与阴性血清在12 kDa处也存在明显的结合条带，是非特异性结合或是其他原因还有待进一步研究。Western blot结果分析与大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆3种鱼与患者血清特异性IgE检测阳性率较高具有一致性，且分子量与文献报道的小清蛋白分子量较一致，因此推断分子量12 kDa左右的特异蛋白条带很可能是鱼类最主要的过敏原小清蛋白。

7种鱼肌浆蛋白的western blot检测中，鲟的特异条带相对最少，这也与ELISA检测中鲟鱼蛋白与血清结合的阳性率最低相一致。鳙、鲤和草鱼3种鱼检出的条带最多，分子量分布在20～60 kDa范围，但3种鱼在ELISA检测中与过敏患者血清结合的阳性率较低，这可能是因为较高分子量范围的蛋白相比12 kDa左右的小清蛋白的致敏性较弱，且患者血清与制备抗体相比在纯度和特异性方面都相差许多，因此可能存在一些非特异性结合的条带。

图3 几种鱼肌浆蛋白与阳性过敏血清(a)和阴性对照血清(b)的Western blot分析Fig.3 Western blot analysis of sarcoplasmic protein of several kinds of fishes with allergic positive serum(a) and negative control serum (b)

3 结论

不同种鱼类的肌浆蛋白与对鱼过敏和虾蟹过敏患者血清特异性IgE的结合能力有所差别，其中虹鳟与血清特异性IgE结合能力最强，血清阳性率最高，其次是大菱鲆和大口黑鲈，鳙、鲤、草鱼和鲟与血清反应的阳性率相对较低。鱼过敏和虾蟹过敏两组患者血清对每种鱼肌浆蛋白的特异性IgE阳性率之间的比较无显著性差异，具有一定的一致性。虾蟹过敏患者血清对不同种鱼存在不同程度的交叉反应，其中对鳙、草鱼和鲟3种鱼类交叉反应较弱。电泳和免疫印迹分析显示与血清结合阳性率较高的大口黑鲈、虹鳟和大菱鲆3种鱼肌浆蛋白在12 kDa左右存在特异蛋白条带，7种鱼类均在免疫印迹分析中检测出不同程度的蛋白条带。本研究检测分析了鱼过敏和虾蟹过敏患者人群中对7种鱼类肌浆蛋白的特异性IgE分布情况，对不同品种鱼类致敏性的研究具有一定的参考价值。

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Detection and analysis of the binding activities of IgE from allergic patients to sarcoplasmic protein of different kinds of fishes

SHI Jing1, LUO Yongkang1*, JIANG Mizu2

1.College of Food Science﹠Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China； 2.Children’s Hospital affiliated with Zhejiang University, Hangzhou 310001, China)

Sera from 80 fish-allergic and only shrimp and crab-allergic patients were collected in Zhejiang region, and the binding activities of IgE in patients sera to sarcoplasmic proteins from 7 species of fish were examined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The protein composition and allergen distribution of fish were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. Results demonstrated that there was no significant difference in specific IgE positive rate between fish allergic and only shrimp and crab-allergic patients. But allergic patients’ sera had different positive rate in reaction with different kinds of fish proteins. The proteins ofOncorhynchusmykiss,ScophthalmusmaximusandMicropterussalmoideswere more allergenic with the positive rate of 70.67%, 46.67% and 26.39%, respectively. In constrast,Aristichthysnobilis,Cyprinuscarpio,CtenopharyngodonidellusandAcipensersinensishad relatively low positive rate. SDS-PAGE analysis showed that the composition of protein was different in 7 fish species. Western blot results showed that the components of fish species had various reaction with positive sera. Thereinto, three species of fish (Oncorhynchusmykiss,ScophthalmusmaximusandMicropterussalmoides), which was higher positive rate, were detected about 12 kDa specific protein bands. In summary, the study was detected and analyzed the specific IgE binding capacity in sera from fish-allergic and shrimp and crab-allergic patients to sarcoplasmic protein of varieties of fish. These provided some references for the diseases prevention of aquatic products and the development of hypoallergenic aquatic food. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):22-28]

fish protein allergy; specific IgE; sarcoplasmic protein; allergic patients serum

LUO Yongkang，luoyongkang@263.net

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.004

2016-07-19；接收日期：2016-09-16

现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-46)

石径(1988-)，女，博士研究生，研究方向为水产品贮藏加工技术，shijing0422@126.com 通信作者：罗永康，教授，博士生导师，研究方向为水产品贮藏加工技术，luoyongkang@263.net

S912；TS254.1

A

2095-1833(2017)01-0022-07