乳腺癌组织中周期素依赖性激酶 10基因启动子甲基化状态检测的临床意义

李文梅，刘佳佳，张印坡，陆建荣

乳腺癌组织中周期素依赖性激酶 10基因启动子甲基化状态检测的临床意义

李文梅，刘佳佳，张印坡，陆建荣

目的探讨乳腺癌组织中周期素依赖性激酶 10(cyclin-dependent kinase 10，CDK10) 基因启动子甲基化状态及其与临床病理参数的联系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应检测 CDK10 基因启动子在50例乳腺癌组织及相应癌旁组织中的甲基化状态并结合临床病理资料进行分析。结果在乳腺癌组织中CDK10 基因甲基化阳性率为 60%(30/50)，癌旁对照组织未出现 CDK10 基因甲基化。 CDK10 基因甲基化同淋巴结转移与临床分期显著相关(P＜0.05)。结论CDK10 基因甲基化与乳腺癌临床分期密切相关，可能是参与乳腺癌发展的重要分子事件。

周期素依赖性激酶 10；DNA 甲基化；乳腺癌

细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)是细胞周期过程中调控众多转录因子发挥核心作用的重要基因。作为 CDKs家族的新成员，CDK10 基因定位于人染色体 16q24.3，编码由 360个氨基酸残基组成的蛋白质[1-3]。 前期研究在雌激素受体(estrogen receptor，ER) 存在的情况下，CDK10基因表达缺失增强乳腺癌细胞对选择性ER调节剂他莫西芬的药物抵抗性[4]。 后续研究证实，CDK10基因作为抑癌基因与恶性肿瘤发生、发展密切相关，基因启动子区域异常甲基化是导致其表达沉默的重要机制之一[5]。 本研究旨在探讨乳腺癌癌组织中CDK10 基因启动子甲基化状态并联系临床病理资料深入分析。

1 材料与方法

1.1 样本 收集陕西省肿瘤医院在 2014—2015 年间手术切除并经病理确诊的 50例原发浸润性乳腺癌组织石蜡样本。 患者中位年龄 50.2(22～71)岁，术前未接受任何放化疗和内分泌治疗。根据美国癌症联合委员会肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis，TNM)标准(第 6 版)分期，具体临床病理资料见表 2。 另外收集相应癌旁乳腺组织 10 例作为对照。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 GTpureTM石蜡组织 DNA 提取试剂盒购自上海基因科技公司，EpiTect Kit 与 HotStar Taq 热启动酶购自德国 Qiagen 公司；脱氧核苷三磷酸与合成引物购自大连 Takara 公司，其他常规化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.2.2 基因组 DNA 提取与亚硫氢酸盐修饰 石蜡组织样本基因组 DNA 提取使用 GTpureTM石蜡组织DNA 提取试剂盒，以 EpiTect Kit 对样本进行亚硫酸氢盐修饰与纯化。

1.2.3 甲基化特异性聚合酶链反应检测 CDK10 基因启动子甲基化状态 甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)反应条件 95 ℃ 预变性 5 min、94 ℃ 变性 1 min、55 ℃退火 30 s、72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环。 引物序列见表1。

表 1 MSP 引物序列

1.2.4 判定 甲基化状态判定标准:仅非甲基化引物扩增出相应片段为甲基化阴性；仅有甲基化引物扩增出相应片段即为完全甲基化，甲基化引物与非甲基化引物均扩增出相应片段为不完全甲基化，完全甲基化和不完全甲基化均计为甲基化检测阳性。

ER 和孕激素受体(progesterone receptor，PR) 表达状态判定:按肿瘤细胞核无着色为 0 分、＜1%为 1分、1%～10%为 2 分、11% ～33%为 3 分、34% ～66%为 4 分、67%～100%为 5 分，染色强度按无、弱、中、强分别评为 0、1、2、3 分。 两者之和，范围为 0 ～ 8分，≤2 分为阴性，＞2 分为阳性。

人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2) 表达状态判定标准:阳性表达定位于细胞膜。 细胞膜无染色，或≤10%的肿瘤细胞染色为“0(阴性)”；＞10%的肿瘤细胞呈弱染色，且细胞膜染色不完整，结果为“＋(阴性)”；＞10%的细胞呈弱至中度染色，细胞膜染色轻度至中度完整，结果为“＋＋(弱阳性)”；＞10%的肿瘤细胞呈细胞膜强染色为“＋＋＋(阳性)”。

1.3 统计学处理 应用 SPSS 17.0 软件，计数资料用率表示，组间比较采用 χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中 CDK10 基因启动子甲基化状态50 例乳腺癌组织中，30 例检测出 CDK10 基因甲基化阳性(60%)，而在 10 例癌旁组织中未出现 CDK10基因甲基化(图 1)。

图 1 MSP 检测乳腺癌组织(T)与癌旁组织(N)中CDK10 基因甲基化状态

2.2 CDK10 基因甲基化与临床病理参数的关系CDK10 基因甲基化有淋巴结转移高于无淋巴结转移(P=0.043)，临床 TNM 分期Ⅲ /Ⅵ期高于Ⅰ/Ⅱ期(P=0.037)。 CDK10 基因甲基化与患者年龄、肿瘤大小、ER、PR 和 HER2 表达状态等因素无关(表 2)。

表 2 CDK10 基因甲基化与临床病理参数的关系

3 讨论

CDK10 基因在细胞周期进程中受到诸多信号通路的精细调控，参与调节神经发育、肝脏纤维化、肿瘤形成等多种生理与病理过程[4-7]。 在恶性肿瘤形成过程中，多数 CDKs基因作为癌基因高表达激活细胞过度增殖；而 CDK10 基因却呈现潜在的抑癌基因特性，在肿瘤细胞中过表达 CDK10 基因可逆转肿瘤细胞的恶性生物学行为[2-5]。

本研究课题组前期应用免疫组织化学法对CDK10 基因在乳腺癌中的表达状态进行了检测，发现 CDK10 基因表达缺失与乳腺癌淋巴结转移、临床TNM 分期和患者总生存期密切相关，CDK10 基因表达可作为乳腺癌预后评判的独立指标[8]。

抑癌基因的失活除突变、杂合性缺失等原因外，基因启动子区域 CpG 岛甲基化是其失活的又一重要机制[9]。 本研究课题组前期研究证实基因启动子高频甲基化是造成 CDK10 基因表达下调的重要原因，通过外周血样本检测 CDK10 基因甲基化有望作为鼻咽癌诊断筛查、监测复发转移以及判断其对放化疗效果反应的生物学指标[4]。 然而，对于 CDK10基因甲基化在乳腺肿瘤中的研究目前鲜见相关报道。本研究发现，CDK10 基因甲基化在乳腺癌组织中的阳性率为 60%(30/50)，而癌旁组织未出现 CDK10基因甲基化，提示 CDK10 基因甲基化发生具有肿瘤特异性。 进一步结合临床病理资料统计分析，发现CDK10 甲基化与肿瘤淋巴结转移、病理分型密切相关。 深入研究 CDK10 基因甲基化在乳腺癌发展中的作用与临床意义，有望为开发临床诊断的分子标志物、确定研发临床治疗的药物靶点以及制定有效的个体化治疗方案提供理论和实验依据。

[1] 游颜杰，李文梅，刘佳佳，等.细胞周期素依赖性激酶 10与肿瘤[J].国际肿瘤学杂志，2014，41(11):811-812.

[2]Zhong XY，Xu XX，Yu JH，et al.Clinical and biological significance of Cdk10 in hepatocellular carcinoma[J].Gene，2012，498(1):68-74.

[3]Yu JH，Zhong XY，Zhang WG，et al.CDK10 functions as a tumor suppressor gene and regulates survivability of biliary tract cancer cells[J].Oncol Rep，2012，27(4):1266-1276.

[4]You Y，Yang W，Wang Z，et al.Promoter hypermethylation contributes to the frequent suppression of the CDK10 gene in human nasopharyngeal carcinomas[J].Cell Oncol(Dordr)，2013，36(4):323-331.

[5]Iorns E，Turner NC，Elliott R，et al.Identification of CDK10 as an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer[J].Cancer Cell，2008，13(2):91-104.

[6]Yeh CW， Kao SH， Cheng YC， et al.Knockdown of cyclindependent kinase 10(cdk10)gene impairs neural progenitor survival via modulation of raf1a gene expression[J].J Biol Chem，2013，288(39):27927-27939.

[7]Guen VJ，Gamble C，Flajolet M，et al.CDK10/cyclin M is a protein kinase that controls ETS2 degradation and is deficient in STAR syndrome[J].Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(48):19525-19530.

[8]You Y， Li H， Qin X， et al.Decreased CDK10 expression correlates with lymph node metastasis and predicts poor outcome in breast cancer patients--a short report[J].Cell Oncol(Dordr)，2015，38(6):485-491.

[9]You Y，Chen Y，Zheng X，et al.Aberrant methylation of the PTPRO gene in peripheral blood as a potential biomarker in esophageal squamous cell carcinoma patients[J].Cancer Lett，2012，315(2):138-144.

Clinical significance of the cyclin-dependent kinase 10 gene promoter methylation in breast cancer

LI Wenmei1， LIU Jiajia1， ZHANG Yinpo2， LU Jianrong3
(1.Department of Pharmacy， Luohe Medical College， Luohe Henan 462000， China；2.Pathological Diagnosis and Research Center， Luohe Medical College， Luohe Henan 462000， China；3.Department of Pathology， Cancer Hospital of Shaanxi Province， Xi’an Shaansi 710061， China)

ObjectiveTo investigate the methylation status of the cyclin-dependent kinase 10(CDK10)gene promoter in breast cancer.MethodsMethylation-specific polymerase chain reaction was performed to observe CDK10 gene promoter methyation in 50 cases of breast cancer tissues companied with their adjacent non-cancerous tissues.The relationship between CDK10 gene methyation and clinical pathological parameters were also analyzed.ResultsMethylated CDK10 gene was frequently observed in 60.0%(30/50)of primary tumors，but not in any normal tissue. CDK10 gene methylation was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM staging of tumors(P＜0.05).ConclusionCDK10 gene methylation may possess a significant function in the development of breast cancer.

Cyclin-dependent kinase 10(CDK10) ； DNA methylation； Breast cancer

R737.9

A

2095-3097(2017)01-0020-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.005

2016-11-30 本文编辑:张在文)

河南省教育厅高等学校重点科研项目应用研究计划(15B320003)

462000 河南 漯河，漯河医学院药学系(李文梅，刘佳佳)，病理诊断与研究中心(张印坡)；710061 陕西 西安，陕西省肿瘤医院病理科(陆建荣)