可溶性白细胞分化抗原 40配体原核表达载体的构建与鉴定

张强，乔录新，吴 涛，刘东杰，纪 乐，陈德喜，吴 刚

可溶性白细胞分化抗原 40配体原核表达载体的构建与鉴定

张志强，乔录新，吴 涛，刘东杰，纪 乐，陈德喜，吴 刚

目的构建原 核 表达载体 pGEX-4T 含 人 可溶性 白 细胞分化 抗 原 40 配 体 (soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand，sCD40L) 重组质粒。方法通过反转录-聚合酶链反应扩增，获得人 sCD40L 的基因片段；将其连接入 T 载体，用 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷与异丙基-β-D-硫代半乳糖苷筛选阳性克隆，鉴定正确后经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切，再与 pGEX-4T 原核表达载体连接，最后经酶切及测序鉴定。结果以L02 细胞的互补 DNA 为模板，扩增出 474 bp 的目的基因；将目的片段与 T 载体连接并进行蓝白筛选得到阳性克隆；构建 pGEX-4T-sCD40L 重组质粒，经转化和筛选获得重组菌，经酶切、基因测序证实序列正确。结论成功构建 pGEX-4T-sCD40L 原核表达载体，为进一步探讨 sCD40L 在肝癌诊断中的作用奠定基础。

可溶性白细胞分化抗原 40 配体；原核表达载体；融合蛋白

人可溶性白细胞分化抗原 40 配体(soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand， sCD40L) Ⅱ 型跨膜糖蛋白，相对分子质量为 39×103，是肿瘤坏死因子超家族成员之一[1]。 CD40L 有 2 种相对分子质量更小的可溶形式；其中 18×103的 sCD40L 具有生物学活性，可看做是一种可溶性的细胞因子。 研究表明，在存在 CD40 表达的肿瘤细胞中，sCD40L可直接抑制肿瘤细胞的增殖，具有调节肿瘤细胞生长与诱导细胞凋亡的作用[2]。 研究发现，CD40-CD40L 相互作用影响肿瘤细胞迁移，这使 sCD40L在癌症中的作用获得广泛的关注[3]。 在癌症患者中，sCD40L 更可能来自活化的血小板而不是来自 T细胞[4]。 因此，sCD40L 可以通过诱导血栓形成反应和释放血管生成相关的细胞因子来影响癌症的发展和恶化。 CD40 在人类癌症中的广泛表达也支持这种配体在癌症发病机制中的作用[5]。 研究显示，在患有某些实体瘤和骨髓增生性肿瘤的患者中血清sCD40L 水平升高[6]。 CD40 在肝癌组织中的表达增加，并且肝癌中表达的 CD40 在肿瘤生物学特别是抵抗 Fas和肿瘤坏死因子受体介导的细胞凋亡中发挥重要作用[7]。

肝细胞 癌 (hepatocellular carcinoma， HCC) 是最致命的恶性肿瘤之一，其相关的发病率和病死率受到密切关注。基于深入审查的肝癌血清学诊断，除了甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)，还有扁豆凝集素反应性 AFP、脱-γ-羧基凝血酶原、表达有免疫球蛋白和表皮生长因子、肌醇蛋白聚糖-3、高尔基蛋白 73、白介素-6 和鳞状细胞癌抗原已作为早期 HCC 检测的生物标志物被提出[8]。 有文献报道，sCD40L 作为肝癌早期检测和肝脏中其他肿瘤性损害的标志物的可靠性作用，肝癌中 sCD40L 作为标志物的优良选择性高于 AFP[9]。 本研究采用重组 DNA 技术，克隆sCD40L 全长互补 DNA(complementary DNA，cDNA)，采用 pGEX-4T-1 表达载体，表达谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)-sCD40L 融合蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常肝 L02 细胞、pGEX-4T 质粒由包头医学院实验室保存。 大肠杆菌 DH5α、BL21 感受态细胞、PMD18-T 载体、RNA 提取、反转录、胶回收、质粒提取试剂盒均购自北京博迈德生物技术有限公司。 限制性内切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、 T7 DNA 连 接 酶 为 美 国 Fermentas 公 司 产品。 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG) 购自德国 SIGMA 公司。 琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂等化学试剂均购自美国 Oxoid 公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的扩增 提取 L02 细胞总 RNA，利用反转录试剂盒将其反转录为 cDNA，-20 ℃ 冻存备用。 根据国家生物技术信息中心检索结果，确定 sCD40L 的编码区序列，设计引物:上游引物 P1为 5′-CGCGGATCCGGTGATCAGAATCCT-3′；下游引物 P2 为 5′-CCGCTCGAGCAGCCTGCAAGGTGAC-3′。扩增片段大小为 474 bp。

反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR) 的 反 应 体 系 为:2 × PCR 混合液 25 μL、上下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL，补充去离子水至总体积为 50 μL。 PCR 扩增条件，94 ℃ 预变性 5 min、94 ℃ 变性 30 s、56 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 30 s，行 30 个循环；最后 72 ℃ 延伸 5 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳验证 PCR 产物，得到 474 bp 扩增片段。利用凝胶回收试剂盒纯化并回收 PCR 产物。

1.2.2 连接 T 载体 将上述纯化回收的 PCR 产物与 PMD18-T 载体进行连接，连接产物转入 DH5α 感受态细胞，使用含氨苄西林( 终质量浓度为 50 mg/ L) 的 Luria-Bertani(LB) 培养基平板 ( 预先用 IPTG与 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷混合液处理) 进行蓝白斑筛选，过夜培养后，挑取白色菌落进行扩大培养，取部分菌液用作模板，用上述设计好的引物进行 PCR 鉴定，将 PCR 鉴定正确的菌液送北京博迈德科技发展有限公司测序。

1.2.3 重组质粒 pGEX-4T-sCD40L 的构建 纯化测序正确的 DNA 片段，用 BamHⅠ和 XhoⅠ分别双酶切该目的片段与 pGEX-4T 载体，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳验证并纯化回收，将纯化回收的片段用T7 DNA 连接酶进行连接。 反应体系 10×连接缓冲液 1 μL、T7 DNA 连接酶 1 μL、载体 1 μL、目的片段4 μL，补去离子水至 10 μL。 充分混匀后室温静置过夜。 次日，将连接产物转化 DH5α 感受态细胞，将转化的 DH5α 涂于氨苄西林抗性的 LB 培养板上，37℃培养箱倒置培养过夜。

1.2.4 酶切及测序鉴定重组质粒 挑取数个单克隆，37 ℃ 培养 12 ～ 16 h 后提取质粒，将 BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确的质粒送北京博迈德科技发展有限公司测序。

1.2.5 pGEX-4T-1/sCD40L 在大肠杆菌中的表达以 pGEX-4T-1/sCD40L 质粒转化到 BL21 大肠杆菌感受态中，挑取单个菌落，接种于 6 mL 含氨苄西林抗性的 LB 培养基，37 ℃ ，200 r/min 过夜培养。 悬液光密度 590 nm 值约为 0.6 时，留取 500 μL 氨苄西林菌液电泳点样，继续加 1 mmol/L IPTG 诱导剂，16℃ 继续培养 14 ～ 16 h，取 500 μL 菌液5 000 r/min 离心 5 min，将沉淀重悬于 40 μL pH 6.8 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中，加入蛋白上样缓冲液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)。

2 结果

2.1 RT-PCR 克隆目的片段 以 L02 细胞的 cDNA为模板，用文中设计的引物 P1、P2 进行 PCR，扩增产物经琼脂糖电泳鉴定，出现片段大小符合预期的单一条带，1.5%琼脂糖电泳结果见图 1。

图 1 PCR 扩增产物

2.2 目的基因连接 T 载体 目的片段与 T 载体的连接产物转化后经 PCR 筛选获得阳性克隆 PMD18-T/sCD40L，测序后经 BLAST 数据库比对序列正确，无终止密码子突变(图 2)。

图 2 PMD18-T/sCD40L 测序

2.3 pGEX-4T-1/sCD40L 的构建及鉴定 PCR 扩增产物与 pGEX-4T 载体连接，经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定，得到预期大小目的片段。 进一步测序验证，该序列与 sCD40L 片段完全一致(图 3)。

图 3 pGEX-4T-1/sCD40L 质粒鉴定

2.4 GST-sCD40L 融合蛋白表达 经 IPTG 诱导的pGEX-4T-1/sCD40L 工程菌的上清中有相对分子质量为 40×103的蛋白，与预期值相符(图 4)。

图 4 GST-sCD40L 融合蛋白表达形式 SDS-PAGE 分析

3 讨论

CD40L 以 2 种形式存在，即细胞膜结合的 CD40L (mCD40L) 和 sCD40L。 当 mCD40L 被蛋白水解酶切割时产生 sCD40L，CD40L 主要表达于 CD4＋T 细胞、血小板、单核细胞、巨噬细胞、B 细胞和自然杀伤细胞上。 CD40 最初被鉴定为 B 细胞受体，其是诱导有效适应性免疫应答的关键。 证据表明，对肿瘤的免疫主要依赖于 CD40-CD40L 相互作用。 CD40和 CD40L 的连接可以导致 sCD40L 从细胞表面脱落并释放到体液中。 与 mCD40L 相比，sCD40L 是功能性三聚体，意味着它可以执行类似于膜结合 CD40L的功能，但只有较少的信号传导强度[10]。 早期研究确定了自身免疫疾病如系统性红斑狼疮以及一系列血管疾病(糖尿病、高血压、外周血管疾病和冠状动脉疾病) 中血清 sCD40L 的水平升高；在癌症患者中，肺癌、未分化鼻咽癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌患者的血清 sCD40L 水平显著高于健康人[11]。 有文献报道，sCD40L 在循环分析中也存在潜在的预后应用[12]。 CD40 在肝癌组织中均异常表达，可作为判断原发性肝细胞癌侵袭转移及预后的指标，并为原发性肝细胞癌的生物治疗提供实验依据[13]。

肝癌是世界上第5位常见和第3位致命的癌症，肝细胞癌占肝癌的 90%[14]。 肿瘤标志物的研究对提高原发性肝癌的诊断有相当重要的意义。目前原发性肝癌诊断的标志物主要是 AFP，但是其敏感性不足，多种肝癌标志物的联合应用检测可以有效提高诊断的敏感性和特异性。如今人们正在寻找更好的、更具特异性和敏感性的肿瘤标志物[15]。 为了进一步研究 sCD40L 基因的功能，本研究采用基因重组技术在大肠杆菌中表达 sCD40L，利用 pGEX 载体所诱导表达的蛋白在 N 端带有 GST标签，方便下一步融合蛋白的纯化和抗体的筛选，便于进一步研究 sCD40L 在肝癌早期诊断中的作用。 由于考马斯亮蓝染色鉴定蛋白诱导表达实验中上样量较少，实验结果显示诱导条带不明显，在后续实验中已经大量提取目标蛋白，并且送公司作为免疫抗原制备出sCD40L 单抗。

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Construction and identification of soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand prokaryotic expression vector

ZHANG Zhiqiang1， QIAO Luxin2， WU Tao1， LIU Dongjie1， JI Le1， CHEN Dexi2， WU Gang1
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology， Baotou Medical College， Baotou Inner Mongolia 014040， China； 2.Beijing Institute of Liver Diseases， Beijing 100069， China)

ObjectiveTo construct containing human soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand(sCD40L)recombinant plasmid pGEX-4T-sCD40L.MethodsThe gene fragment of human leukocyte sCD40L was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RTPCR).The fragment was ligated into T vector and ligated with 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside(X-gal)and isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG).The positive clones were screened by IPTG.The positive clones were digested with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ， then ligated with pGEX-4T prokaryotic expression vector， and identified by restriction enzyme digestion and sequencing.ResultsThe target DNA fragment of 474 bp was amplified by the complementary DNA(cDNA) of L02 cells.The recombinant plasmid pGEX-4T-sCD40L was constructed by ligating the target fragment with T vector and screening for blue-white.The recombinants were obtained by transformation and screening， and the sequences were confirmed by restriction enzyme digestion and gene sequencing.ConclusionThe prokaryotic expression vector pGEX-4T-sCD40L has been successfully constructed， which lays a foundation for further study on the role of sCD40L in the diagnosis of hepatocellular carcinoma(HCC).

Soluble cluster of differentiation antigen 40 ligand(sCD40L) ； Prokaryotic expression vector； Fusion protein

R392.11

A

2095-3097(2017)01-0012-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2017.01.003

2016-12-19 本文编辑:徐海琴)

国家自然科学基金资助项目(81361120401)；首都卫生发展科研专项项目(首发 2014-1-1151)

014040 内蒙古 包头，包头医学院生物化学与分子生物学教研室(张志强，吴 涛，刘东杰，纪 乐，吴 刚)；100069 北京，北京市肝病研究所(乔录新，陈德喜)