红细胞膜磷脂水平与急性缺血性卒中的关系

韩威+王笑宇+吴越+王德才

[摘要] 目的 该文采用高效液相色谱技术，对急性缺血性卒中患者红细胞膜磷脂含量分析，探讨红细胞膜磷脂水平在急性缺血性卒中发生、发展中的作用机制。方法 采用流行病学横断面调查方法，自2015年7—10月筛选病例组人群22例，健康对照组人群24名，分离红细胞膜，用HPLC，XBP-Silica柱分离，测定两组人群红细胞膜磷脂含量，数据采用SPSS 20.0统计学软件分析。结果 5种磷脂中脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）3种磷脂病例组含量（0.3796±0.1387）、（0.4498±0.1786）、（0.3301±0.0327）与对照组（0.4897±0.0154）、（0.5523±0.0107）、（0.6351±0.0599）数值差异有统计学意义（P< 0.05），磷脂酰肌醇（PI）和神经鞘磷脂（SM）差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 红细胞膜磷脂水平参与影响了急性缺血性卒中的发生发展过程，可能是急性缺血性卒中发生发展的一个诱导机制。

[关键词] 急性缺血性卒中；红细胞膜；磷脂

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）12（a）-0031-04

脑卒中是一种高发病率、高致残率、高死亡率的疾病。而缺血性卒中在我国约占卒中总数的70%[1]。大量研究发现急性缺血性卒中患者存在红细胞膜脂质成分的改变，但对红细胞膜磷脂含量的变化，结论不一。组成细胞膜的磷脂主要包括磷酯酰丝氨酸（PS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、神经鞘磷脂（SM）等，这些磷脂在血细胞膜上的含量远远大于血清中的含量。因此该文采用高效液相色谱（HPLC）技术高效液相色谱法自2015年7—10月对筛选病例组人群22例，健康对照组人群24名患者血清中 5 种磷脂磷脂含量水平分析，从而探讨红细胞膜磷脂水平与急性缺血性卒中的关系。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

高效液相色谱（Agilent 1260），超声波清洗器（ KQ-100DB），超纯水仪（Millipore美国），分析天平（AR1140，美国）。磷脂酰丝氨酸标准品（PS 90%） 、磷脂酰胆碱标准品（PC 98%） 、磷脂酰肌醇标准品（PI 98%） 、磷脂酰乙醇胺标准品（PE 98%）、神经鞘磷脂标准品（SM 98%） 均购自瑞典Larodan 公司；乙腈、甲醇、磷酸、氯仿、己烷、异丙醇（ 天津市光复精细化工研究所） 。

1.2 调查对象收集与筛选

该研究对象来自黑龙江省林总医院自2015年7—10月住院的急性缺血性卒中患者，年龄在60～75岁之间，共计22例（男12例/女10例），排除冠心病、糖尿病及其他具有精神疾病者等，作为病例组。对照组在哈尔滨第二福利医院健康老年人中选取，年龄与病例组相匹配，共计24人（男12/女12）。所有研究对象均由本人或监护人签署知情伦理同意书，自愿参加和退出，自愿接受问卷调查和实验室检查。

1.3 红细胞膜中磷脂的提取

取受试对象晨起空腹肘静脉血，经低温离心、洗涤、沉淀等处理，获得白色的红细胞膜样品。然后，取红细胞膜悬浮液加入0.5 mL的提取液[氯仿-甲醇（体积比2：1）]，冰浴匀浆3 min。加入提取液4 mL，于30℃保温30 min，以3 000 r/min离心5 min，取下层液过滤除蛋白。滤液加0.9%Nacl 0.4 mL，振摇1 min，以3 000 r/min离心5 min，弃上层液。加0.4 mL氯仿-甲醇-水（体积比8：4：3）振摇、静置，以3 000 r/min离心5 min，弃上层液，氮气吹干。残渣用 2 mL 正己烷-异丙醇（3∶1） 溶解，经有机滤膜过滤于样品瓶，备用。

1.4 色谱条件

流动相为乙腈：甲醇：85%磷酸（体积比为100：10：1.8）。色谱分析柱以XBP-Silica （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相检测波长为203 nm，进样量10 μL，柱温25℃，流速1.5 μL/min。

1.5 样品测定

取处理完成的红细胞膜磷脂提取物，在上诉色谱条件下，取10 μL进样分析，同时绘制标准曲线，采用外标法定量，相对保留时间定性。标准色谱图和样品图见图1。

1.6 统计方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据统计分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，组间资料比较采用ANOVA检验， P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法的质量控制

2.1.1 线性范围和检出限 该文以外标方法进行定量分析，因此对方法的线性范围和检出限进行了试验，以峰面积（x） 对磷脂浓度（y） 做線性回归，按色谱峰的 3 倍信噪比（S/N） 计算各磷脂组分的检测限（LOD），10倍（S/N） 信噪比确定定量限（LOQ），结果见表1。从表1可见，该方法线性关系良好。

2.1.2 重复性实验 取高、中、低3种浓度的磷脂混合溶液，各浓度平行测定6次，计算精密度；在1 d内重复进样6次并连续进样6 d。结果见表2，各磷脂的变异系数均小于1.99%，PI、PC、PS、PE、SM的日内与日间变异均小于1.86%，该方法精密度良好。

1.2.3 准确度 取血清样品 100 μL，加入 5 种磷脂混合标准溶液，分高、中、低 3 个浓度，考察方法准确度。结果回收率PI为82.06%～97.00%；PE为88.12%～104.36%；PC为90.39%～104.53%；PS为90.46%～99.17%；SM为86.57%～104.55%。显出良好的准确性。

2.2 CVA组与对照组红细胞膜磷脂水平

表3列出了病例组组与对照组红细胞膜中5种磷脂的测定结果，从中可见磷酯酰丝氨酸（PS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）的含量差异有统计学意义（PS：P<0.001、PC：P<0.01、PE：P<0.01）。五种磷脂的总含量（PL），相对于对照组，病例组明显减少（P< 0.001），而红细胞膜中磷脂酰肌醇（PI）和神经鞘磷脂（SM）在病例组与对照组之间差异无统计学意义P>0.05。

为衡量脂质过氧化程度，比较细胞膜成分变化，我们将甘油磷脂与神经鞘磷脂做比率，结果如表4所示。PI/SM的比值在CVA组与病例组中差异无统计学意义（P>0.05）；PC/SM在CVA组与病例组间差异无统计学意义（P > 0.05）；PE/SM在CVA组与对照组间差异有统计学意义（P<0.001）；PS/SM在CVA与病例组之间差异有统计学意义（P <0.001），以上结果提示红细胞处于高水平脂质过氧化状态。

3 讨论

红细胞膜的主体为磷脂排列的双分子层的结构，其中包含蛋白质贯穿在细胞膜中，红细胞膜的磷脂作为红细胞的重要组成成分，其包括组成内层的磷酯酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）和组成外层的磷脂酰胆碱（PC）和神经鞘磷脂（SM）[2]。红细胞膜磷脂中PS包含大量的二十二碳六烯和花生四烯酸[3]。在人类红细胞膜中PS比PE、PC含有更多的PUFA[4]。磷脂富含大量PUFA易发生氧化应激，之前有研究报道过当红细胞与叔丁基过氧化物反应SM相对于PC、PE、PS的组分增加，因此，每个甘油磷脂与SM的比率是一个很好的恒量过氧化程度指标。

PS通过甲基化可生成乙酰胆碱的前体物质即磷脂酰胆碱，PS还可以调节细胞膜的流动性，并介导细胞膜受体与第二信使间的相互作用；Suzuki等[5]发现，PS具有促进乙酰胆碱的释放的作用。PE在体内不同的磷脂酶作用下，可水解成甘油、不饱和脂肪酸、胆碱和磷脂，这些成分在体内有着非常重要的生物学作用。其中，胆碱在体内生物酶的作用下与乙酰辅酶A反应生成乙酰胆碱，乙酰胆碱对于大脑记忆区胆碱能神经元及神经突触的形成有关键性作用，可促进脑发育，提高记忆能力[6]。并且越来越多的研究表明脑卒中病的进程与炎症相关，而脂类介质在炎症消退的过程中发挥了特殊的起动作用，如不饱和脂肪酸（PUFAs），其作为PE的水解产物可能是脑卒中病的保护因素。G-6-P酶具有较强的磷脂依赖性，其依赖于PE，参与许多糖代谢途径。糖代谢异常或许成为重要的急性缺血性脑卒中发病机制。有研究显示，在急性缺血性脑卒中患者早期脑内某些区域具有异常的葡萄糖代谢率及能量代谢障碍[7]。SM可以在神经酶的作用下形成神经酰胺，而近年来研究发现，神经酰胺的超量集聚或许与某些代谢综合征有着紧密的联系[8]。实验结果显示，病例组与对照组相比，红细胞膜中PE/SM（×100）[HC=49.7±8.1，CVA=44.91±6.6]、PS/SM（×100）[HC=14.8±7.2，CVA=8.3±7.4]的比值有所降低，而PC/SM和PI/SM在病例组和对照组中之间差异无统计学意义（P> 0.05）。参照邓华聪等[9]研究中细胞膜磷脂发生过氧化时PE/SM（×100）[HC=141.8±22.7，CVA=144.2±31.4]、PS/SM（×100）[HC=75.3±14.1，CVA=63.85±16.9]，该实验中PE/SM、PS/SM远远小于上述数值，表明红细胞处于较高水平的脂质过氧化反应。ROS的过量产生会引发机体抗氧化失衡，使细胞膜受到氧化攻击产生损伤，破坏细胞膜的完整性，最终导致细胞结构和功能的改变。

综上所述，急性缺血性卒中患者同对照组研究对象相比，磷脂水平明显降低，甘油酰磷脂与神经鞘磷脂的比值PE/SM、PS/SM在病例组与对照组有统计学差异，膜磷脂含量发生改变提示红细胞膜磷脂的高水平过氧化反应。表明急性缺血性卒中患者磷脂水平可能在急性缺血性卒中的发生发展中发挥重要作用，这可能作为脑卒中未来靶向治疗研究的一个方向。

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（收稿日期：2016-09-09）