DHMEQ对降植烷诱导的狼疮性肾炎的作用及机制研究

曲惠青+朱烨+高乐俊+张力

[摘要] 目的 探讨NF-κB抑制剂DHMEQ对降植烷诱导狼疮性肾炎小鼠模型的作用。方法 方便选取2012年7月—2015年12月用降植烷诱导形成狼疮性肾炎动物模型24例，研究DHMEQ对该模型的治疗效果，探讨DHMEQ对狼疮性肾炎的影响。结果 DHMEQ拮抗升高的抗核小体，抗dsDNA抗体和抗组蛋白自身抗体以及 IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α起到拮抗作用。DHMEQ可降低降植烷诱发的肾脏病变。磷酸化p38促分裂原活化蛋白激酶 （MAPK），磷酸化c Jun氨基末端激酶（JNK）和NFκBp65的肾表达水平（MAPK）显著下调。结论 DHMEQ通过调节细胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信号通路对降植烷诱导狼疮性肾炎产生有利影响。

[关键词] 狼疮性肾炎；NF κB；脱氢环氧甲基醌霉素（DHMEQ）

[中图分类号] R4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）12（a）-0027-04

系统性红斑狼疮（SLE）是一种以体液自身免疫引起细胞和先天免疫反应为特征的自身免疫性疾病的原型[1]。狼疮性肾炎（LN）与SLE的不良预后相关。虽然激素联合免疫抑制剂显著改善了狼疮性肾炎患者的预后，但是也增加了感染和肿瘤的发生几率，因此急需新的治疗手段。NFκB作为参与免疫应答调控的关键转录因子，在多个研究中发现其参与自身免疫性疾病的发生发展[2]。NF κB在很多信号通路[3]的交汇点发挥作用。因此，通过抑制NFκB信号通路可以改善狼疮性肾炎[4]。从2012年7月—2015年12月，选取BALB/c 小鼠24例，通过降植烷诱导形成狼疮性肾炎动物模型24例，研究DHMEQ对该模型的治疗效果，探讨DHMEQ对狼疮性肾炎的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性BALB/ c小鼠[年龄8周，体重（18±2）g]24只由山东大学实验动物中心提供。该研究经过滨州医学院附属医院动物实验伦理委员会批准。

1.2 实验方法

雌性BALB/ c小鼠，随机分为对照组和DHMEQ治疗组（n=12）。小鼠8周龄注射降植烷，16周龄后给予腹腔注射终浓度1.2 mg/mL DHMEQ或配药液，3次/周，持续注射16周，直到小鼠达到32周龄。分别于8周，16周和32周采集尾静脉血检测自身抗体的水平。小鼠于32周时颈椎脱臼法处死并取肾脏组织用于免疫学检测和镜下检测。

1.3 自身抗体检测

用酶联免疫测定法（ELISA）对血清IgG抗核小体抗体，dsDNA和组蛋白水平进行检测。流式细胞术来检测小鼠IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平。

1.4 肾功能评估

为了评估尿蛋白排泄量，将小鼠置于代谢笼中并于24 h内收集尿样。考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。获取处死小鼠后，取肾脏切片以及年龄匹配的C57BL/6对照小鼠，用Olympus BX60显微镜进行分析。用Image J软件对染色强度进行定量分析。

1.5 肾脏蛋白质印迹分析

蛋白提取使用RIPA试剂。上样量为20 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳后将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。2% BSA封闭后，孵育于1∶2 000稀释的一抗检测p p38 MAPK，p JNK或 NF κB p65，使用HRP二抗，ECL发光液显色后，通过图像分析系统进行定量。GAPDH作为对照。

1.6 统计方法

数据使用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（x±s）表示。对数据进行t检验和单因素方差检驗，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DHMEQ降低抗dsDNA抗体，抗核小体和抗组蛋白抗体的血清水平

在16周和32周，对照组的血清dsDNA抗体水平明显增加。与对照组相比，DHMEQ组dsDNA抗体水平在32周明显降低（图1A）。同样， DHMEQ组的血清抗核小体和抗组蛋白抗体水平在32周时也显著下降（图1B和C）。

2.2 DHMEQ减少炎性细胞因子的表达作用

对照组的IL-1β，IL-6和IL-17以及TNF-α的水平明显增加。DHMEQ治疗组的细胞因子水平几乎正常，明显低于对照组（P <0.05，图2）。

2.3 DHMEQ降低降植烷诱导狼疮小鼠中的狼疮性肾炎

在32周时（24周内给予降植烷注射），DHMEQ组的尿蛋白排泄量较对照组明显降低。另外， DHMEQ组的肾脏HE染色切片显示肾小球损伤小于对照组（图3B）。

2.4 DHMEQ抑制肾脏NF -κB和JNK/ P38 MAPK信号通路

NFκB p65蛋白作为NFκB信号活化的指标，经DHMEQ处理后下调。而且降植烷诱导狼疮小鼠中的JNK磷酸化水平和p38蛋白在小鼠肾组织的水平明显降低。

3 讨论

DHMEQ是由拟无枝酸菌属的菌种发酵纯化制得的抗生素。与其他NF-κB抑制剂靶向IκBα的磷酸化水平不同，DHMEQ抑制NF-κB的组成部分p65的核转位 8。DHMEQ在动物中未表现出明显的毒性[7-8]，表明该化合物的安全性。该研究发现DHMEQ可以拮抗狼疮中不断增加的抗核小体，抗dsDNA抗体和抗组蛋白抗体，以及TNF-α，IL-1β，IL-6和IL-17水平。此外，可显著减少降植烷引起的肾脏病变，表现为降低蛋白尿和肾小球病理变化的降低。 p38MAPK， p JNK和NF - κBp65的肾表达水平被显著下调。上述研究结果表明，DHMEQ通过调节细胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信号通路对降植烷诱导的狼疮性肾炎产生有利影响。

NF-κB活化基礎水平的升高与慢性炎症性疾病[9]相关联。NFκB家族的转录因子是由抑制剂，包括IκBα来调节的。与野生型小鼠相比，易感狼疮小鼠的脾脏和树突状（DC）细胞中发现IκBα的表达水平较低，表明NFκB在狼疮小鼠中异常活化。NFκB可以影响DC的功能并调节其适应性免疫4的能力。现已证实，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中[10]观察到NFκB阻滞干扰不必要的T细胞应答。此外，在自发狼疮模型MRL / lpr小鼠中，抑制NFκB介导的炎症反应证明对LN有效[11]。该研究提供了新的证据表明NFκB的药物抑制在降植烷诱导狼疮小鼠中可能显著降低狼疮疾病的不良影响。

越来越多的证据表明NFκB参与自身反应性T和B淋巴细胞发育，存活和增殖，并通过细胞因子（包括TNF-α，IL-1，IL-6和IL-17）参与维持慢性炎症。因此，NFκB介导的炎症反应可能有助于SLE的器官损伤11。在该研究中我们发现DHMEQ能够拮抗不断提高的IL-1β，IL-6和IL-17和肿瘤坏死因子α水平。此外，一些研究表明p38 MAPK/JNK信号转导通路在调节细胞和体液免疫应答[12-13]中起重要作用。现已证明DHMEQ作为p38 MAPK的特异性抑制剂，在SLE的MRL/lpr小鼠模型中是有效的，表现为能够改善肾功能和减少组织学损伤[13]。该研究的发现，通过DHMEQ处理能够抑制MAPK/JNK信号传导途径。这些结果表明，DHMEQ通过阻断NFκB/ MAPK/JNK介导的炎性反应在SLE中发挥治疗作用。

总之，该研究的结果表明DHMEQ通过调节细胞因子水平和MAPK/ JNK/ NFκB信号通路对降植烷诱导狼疮性肾炎产生有利影响。该结果支持了NFκB阻滞可能是减少有害的自身免疫反应的重要药物方法的假设。

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（收稿日期：2016-09-08）