辽宁地区猪源大肠埃希菌整合子携带情况调查与分析

赵凤菊，李清竹，关 淼，李井春，王 竹，曹 东，赵晓彤，顾贵波，魏 澍

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164)

辽宁地区猪源大肠埃希菌整合子携带情况调查与分析

赵凤菊，李清竹，关 淼，李井春，王 竹，曹 东，赵晓彤，顾贵波，魏 澍

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳 110164)

查明辽宁地区整合子在猪源大肠埃希菌中的分布及整合子携带耐药基因盒的种类，可为该病的综合防控提供科学依据。本研究利用整合酶基因PCR扩增法检测整合子，并对整合子可变区进行扩增测序。结果表明，71.43%(40/56)的菌株为Ⅰ类整合子阳性，1.79%(1/56)的菌株同时为Ⅰ类和Ⅱ类整合子阳性，未检测到Ⅲ类整合子；87.8%(36/41)的菌株表现为Ⅰ类整合子可变区扩增阳性，扩增产物大小在116 bp～2 307 bp之间，100%(1/1)菌株表现为Ⅱ类整合子可变区扩增阳性，大小为2 106 bp；整合子可变区含有编码对氨基糖苷类抗生素耐药的基因(aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、aacA4和sat2)，编码对磺胺类抗生素耐药的基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17)，编码对氯霉素抗生素耐药的基因(cmlA1、cmlA6)。因此，整合子在大肠埃希菌中广泛存在，辽宁地区大肠埃希菌中整合子主要携带编码对氨基糖苷类、磺胺类和氯霉素耐药基因盒。

猪；大肠埃希菌；整合子；耐药性

大肠埃希菌(E.coli)是人类与动物肠道内共生菌，也是细菌耐药性监测的重要指示菌[1]。整合子由Stokes等于1989年首次提出，在革兰阴性病原菌中比较常见，根据整合酶基因(intI)的同源性已经确定了四类整合子(1～4)[2]。最常见的移动性整合子是Ⅰ类整合子，其次为Ⅱ类整合子，已经被证明了有助于抗生素耐药基因的传播[3]。整合子位于细菌染色体或质粒上，它能够捕获外源基因，通过位点特异性重组功能促进细菌获得抗性基因的新组合，并能促进抗性基因在细菌之间传播，导致多耐药菌株的出现[3-5]。通过国内外学者的大量研究证明，细菌间特别是在肠杆菌如大肠埃希菌中整合子的存在与多药耐药密切相关。由于动物源耐药菌和耐药基因可以通过食物链传播给人类[6]，因此，多药耐药现象的出现不仅给动物疫病治疗带来巨大挑战，也严重威胁到人类健康。

通过对辽宁地区猪源大肠埃希菌的耐药性分析发现，菌株耐药率高达98.64%(64/65)，多重耐药率高达92.31%。抗生素的不适当使用以及作为生长促进剂的使用，是抗生素耐药性发展的重要原因。整合子在细菌获得耐药机制中起了重要作用，整合子基因盒系统在细菌中能捕获外来耐药基因，不仅可在不同细菌间传播耐药性，也可同时1个整合子捕获多个基因盒产生多重耐药性[7-8]。因此，为了解辽宁地区整合子在猪源大肠埃希菌中的分布及整合子携带耐药基因盒的种类，本研究利用整合酶基因PCR扩增法对56株耐药大肠埃希菌进行整合子检测，并对整合子可变区进行扩增及序列测定分析，为进一步研究猪源大肠埃希菌的耐药机制奠定基础，也为猪源大肠埃希菌耐药性监测提供科学参考，为辽宁地区猪大肠埃希菌病的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 56株耐药大肠埃希菌由辽宁不同地区病死猪或患病猪的组织脏器、活猪粪便中分离得到。由辽宁省动物疫病预防控制中心实验室鉴定并保存。

1.1.2 培养基及试剂 营养琼脂培养基、麦康凯培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品，生产批号分别为20130608、20130708；DNAzol提取试剂、Invitrogen、PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GD buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5mmol/L dNTPs、DNA Marker 2 000、溴化乙锭，宝生物工程(大连)有限公司产品；其他为实验室常规试剂。

1.1.3 PCR扩增引物 Ⅰ类整合酶基因根据GenBank上登录的intI1基因序列，利用Primer Premier5.0软件自行设计，Ⅱ类和Ⅲ类整合酶基因及Ⅰ类和Ⅱ类整合子引物参照参考文献[2-4]合成。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 细菌DNA模板的制备 挑取18 h～24 h培养的培养物，用1 mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。吸取200 μL菌悬液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取试剂，混匀后4℃、12 000 r/min离心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL无水乙醇，混匀后4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清，无菌水配制的750 mL/L乙醇洗涤2次，干燥后用40 μL无菌水溶解沉淀，-20℃保存备用。

1.2.2 整合酶基因及整合子检测体系 采用25 μL反应体系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，灭菌水16.375 μL，模板 2 μL。

1.2.3 基因测序检测体系 采用50 μL反应体系，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Prime STAR GD buffer(Mg2+plus)25 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，上、下游引物各1 μL(引物浓度为20 μmol/L)，模板5 μL，灭菌水补至50 μL。

1.2.4 PCR反应条件 94℃ 5 min；94℃ 45 s，根据不同引物选择相应的退火温度 45 s，72℃ 50 s，35个循环；72℃ 10 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

1.2.5 扩增产物的序列测定 选取整合子PCR阳性样品，将其PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，并与NCBI基因库进行序列同源性比较。

2 结果

2.1 整合酶基因及整合子检测结果

通过对56株耐药大肠埃希菌进行整合酶基因及整合子检测，71.43%(40/56)的大肠埃希菌为Ⅰ类整合子阳性，1.79%(1/56)的大肠埃希菌同时为Ⅰ类、Ⅱ类整合子阳性，未检测到Ⅲ类整合子。在41株Ⅰ类整合子阳性的大肠埃希菌中，有36株(87.8%)表现为整合子可变区扩增阳性；1株Ⅱ类整合子阳性的大肠埃希菌表现为整合子可变区扩增阳性。在这些Ⅰ类整合子阳性菌株中， 150 bp为22株， 1000 bp为1株， 2 000 bp为13株。Ⅱ类整合子阳性菌株，2 000 bp为1株。

2.2 整合子可变区扩增产物的序列测定结果

对Ⅰ类整合子可变区PCR扩增产物进行序列测定，将测序结果与GenBank数据库进行比对，以确定耐药基因盒类型(表2)。测序结果表明，G1的扩增产物为2 307 bp的片段中含有cmlA1-aacA4 基因。H1的扩增产物为1 867 bp的片段中含有aadA2-linF 基因；K1、P1、P2的扩增产物为1 835 bp的片段中含有dfrA12-orfF-aadA2基因。K2、F1、C1的扩增产物为1 583 bp片段中含有dfrA17- aadA5基因。A2的扩增产物为1 505 bp的片段中含有dfrA1- aadA1 基因。A1的扩增产物为1 260 bp的片段中含有cmlA6-aadA1-aadB 基因。C2的扩增产物为916 bp的片段中含有aadA22 基因。同源性均为98%～100%。A3、C4、G2、G3、G4扩增产物为116 bp的片段中无耐药基因。

对Ⅱ类整合子可变区PCR扩增产物进行序列测定，将测序结果与GenBank数据库进行比对以确定耐药基因盒类型。测序结果表明，C3的扩增产物为2 106 bp片段中含有dfrA1-sat2-aadA1 基因，同源性为100%。

表2 大肠埃希菌整合子的特征

3 讨论

在细菌通过可移动遗传元件如质粒、转座子和整合子传播耐药基因中水平基因转移具有重要作用[10]。整合子能够在它们的结构中整合耐药基因盒，超过194种基因盒编码氨基糖苷类、β内酰胺类、氯霉素、喹诺酮类和甲氧苄氨嘧啶抗性[11]。在整合子中可以整合1个或多个基因盒，通常不超过5个基因盒[5]。整合子在人、动物和农养鱼细菌中均有报道，在革兰阴性病原菌耐药性的发展中起着重要作用[1]。

本项研究发现，71.43%(40/56)的大肠埃希菌携带Ⅰ类整合子，1株大肠埃希菌同时携带Ⅰ类和Ⅱ类整合子。在Ⅰ类整合子中58.33%(7/12)的菌株携带编码甲氧苄啶-链霉素耐药基因，16.67%(2/12)的菌株携带编码氯霉素-氨基糖苷类耐药基因，16.67%(2/12)的菌株携带编码链霉素耐药基因。在Ⅱ类整合子中携带编码甲氧苄啶-链丝菌素-链霉素耐药基因。由此可见，整合子在辽宁地区猪源大肠埃希菌中普遍存在，主要携带Ⅰ类整合子。整合子中检出了携带含有磺胺类、氨基糖苷类及氯霉素相关耐药基因的基因盒，从而造成携带耐药基因盒的菌株对磺胺类、氨基糖苷类及氯霉素类抗生素耐药，导致大肠埃希菌多重耐药的形成。

在既往的研究中发现，整合子在大肠埃希菌的多重耐药和耐药传播中发挥了重要作用。因此，研究大肠埃希菌中整合子的种类及所携带耐药基因的构成，对大肠埃希菌所致疾病的综合防治具有重要意义。

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Investigation and Analysis of Whole Carrying Integrons ofEscherichiacolifrom Swine in Liaoning Area

ZHAO Feng-ju,LI Qing-zhu,GUAN Miao,LI Jing-chun,WANG Zhu,CAO Dong, ZHAO Xiao-tong,GU Gui-bo,WEI Shu

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang,Liaoning,110164,China)

In order to understand the distribution of integrons and types of drug resistance gene cassette inEscherichiacolifrom swine in Liaoning area,and to provide a scientific basis for the comprehensive prevention and control of the disease,the integrons were detected by integrase gene PCR,and variable region of the integron was amplified and sequenced.Results showed that 71.43%(40/56)of the strains were shown to be class Ⅰintegron positive,1.79%(1/56)of the strains were shown to be classⅠ and classⅡ integron positive,and no classⅢ integron was detected.87.8%(36/41)of the positive strains of classⅠintegron contained a gene cassette,which sized from 116 bp to 2 307 bp,100%(1/1)classⅡ integron positive strain contained a 2 106 bp size gene cassette.These gene cassettes included genes encoding resistance to aminoglycosides (aadA1,aadA2,aadA5,aadA22,aadB,aacA4,sat2),sulfonamides (dfrA1,dfrA12,dfrA17),chloramphenicol (cmlA1,cmlA6).Therefore,integrons are widespread inE.coli,theE.colimainly carried resistance gene cassettes of aminoglycosides,sulfonamides,and chloramphenicol in Liaoning.

swine;Escherichiacoli; integron; drug resistance

2016-06-03

辽宁省自然科学基金项目(201402573)；辽宁省农业攻关及产业化项目(2015202013)；2014年中央财政农业科技推广示范项目(2130106)

赵凤菊(1978-)，女，河北廊坊人，高级兽医师，硕士，主要从事动物人畜共患病的防控与研究。

S852.612；S858.28

B

1007-5038(2017)01-0115-04