公猪精液常温液态保存的研究进展

李 琦，李雁冰，黄大鹏，魏国生*，李井春*

（黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

专论综述

公猪精液常温液态保存的研究进展

李 琦，李雁冰，黄大鹏，魏国生*，李井春*

（黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

由于猪精子对于冷休克的应激反应较为敏感，使得猪精液的常温液态保存比冷冻保存得到了较快得发展。本文就猪常温精液的定义及外界影响因素、稀释液中的添加物质以及稀释粉（液）配方的设计等几个方面进行了总结，阐述了影响猪常温精液保存效果的几个主要因素，探讨了猪常温精液保存研究中的一些问题并做了展望。

猪精子；常温保存；影响因素；精液品质

在2011年1月1日实行的《猪常温精液生产与保存技术规范》国标中定义猪的常温精液为“经稀释后在16～18℃下短期保存，仍具有受精能力的精液”。国家相关技术规范的制定有利于猪精液常温保存技术的发展及应用。

与其他动物精液冷冻保存相比，猪精子由于其膜的磷脂酰胆碱含量较低，而磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂含量较高，胆固醇在质膜上分布不对称，并且胆固醇/磷脂比率显著低于其他哺乳动物精子，这就使得猪精子对低温的敏感程度较其他动物要高。正是由于猪精子对于冷休克的应激反应较为敏感，所以在猪精液的冷冻保存方面应用较少[1]。目前，国内使用人工授精技术的猪场95%以上应用的精液是常温液态保存的。现将猪精液常温保存的研究进展做一综述。

1 猪常温精液保存的物理影响因素

猪精液的常温保存常受到温度、pH值、渗透压等的影响。由于猪精子自身条件的限制，在常温条件下如何提高精液的保存时间以及保存质量，这将会给今后种猪繁育事业带来广阔的应用前景。

1.1 温度

低温会导致猪精子产生冷休克现象，而且这种现象是不可逆的。所以在精液稀释前常将精液置于室温或30℃条件下数小时，使精子对低温产生一定的耐受能力，这将对延长精子的保存时间、保证精子的存活率和顶体的完整性有一定积极的作用，但机理有待进一步研究[2]。通过相关学者不断地摸索与研究，逐渐确立15～20℃为猪精液液态保存的最适范围，而16～18℃在生产中应用最为普遍[3]。精液的在较高温度下，其质量与精子质膜上的热休克蛋白有关[4]。温度低于14℃或超过20℃则会降低精液的保存时间以及精液的品质。

1.2 pH值和渗透压

新鲜猪原精的pH值在7.2～7.5之间，适当的低pH值可以降低精子的代谢和运动水平。在附睾内精子可以存活30～60 d，这与附睾内环境呈弱酸性（6.2～6.8）有很大的联系[5]。一系列的研究证明，偏酸性的环境有利于精子的保存。在稀释液添加NaHCO3、柠檬酸钠等缓冲剂有利于平衡精子以及细菌的代谢产物，维持一个动态的相对平衡的酸碱环境，可以防止因保存液的过度酸化而导致精子成活率下降等问题的发生。当精液保存液的pH为5.7～6.4时，精子的顶体发生异常的情况会增加[6]。除上述的缓冲剂外，一般还会在保存液中添加一些具有金属螯合能力的两性缓冲剂，如HEPES等。

猪精子的渗透压在290～300 mosM，可耐受的渗透压为240～380 mosM。精子可以在附睾中存活较长的时间，还与附睾中的渗透压偏高有关。附睾中的渗透压为400 mosM，使精子发生脱水现象，导致精子缺乏运动所需最低水分，使得精子不能运动，但在体外条件下精子却无法承受这种高水平的渗透压，可能与精子是否获能有关。稀释液的离子浓度对维持渗透压没有太大的作用，但离子浓度过高会造成精子表面蛋白溶解和脱落，给精子造成损伤。

1.3 微生物

在精液的体外保存过程中不可避免会受到细菌等微生物的影响。猪精液常温保存稀释剂中 一般含有葡萄糖，其作用是为精子的生命活动供能，但在精液常温保存的温度条件下葡萄糖会被绝大多数微生物细菌所利用。其作用方式包括竞争营养物质导致精子活力下降、含有凝集因子使精子聚集、降低环境渗透压造成顶体肿胀以及无氧发酵使糖分产酸，从而导致p H降至酸性（5.7～6.4）等。一般排除特殊环境的影响，精液中的微生物主要以肠杆菌和少量的葡萄球菌属和丝状真菌为主。大肠杆菌等革兰氏阴性菌对精液保存的影响较大，会造成精液质量下降[7]。多种微生物污染的精液，精子活力会严重下降，有效保存时间缩短，使用这样的精液进行人工授精会产生严重的影响。负面效应包括母猪受孕率降低、母猪猪群生产性能降低、造成母猪子宫内膜炎、病原感染，从而进一步增加母猪淘汰率。

为了将这种损害降到最低，人们在精液的稀释液中添加不同种类的的抗生素如青霉素、链霉素等。一般青霉素钠的添加量为0.6 g/L，硫酸链霉素的添加量为1 g/L。添加抗生素可以杀死或抑制有害细菌，延长精液的保存时间，提高受精能力。但是，随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性不断增强。青霉素在稀释精液中12 h效价降低50%，精子保存时间和效果均无法达到理想效果。可见，过去常在精液稀释液中添加的青霉素和链霉素已无法有效抑制细菌微生物生长繁殖。随着青霉素在稀释精液中作用的减弱，不断有学者研发新的抗生素。由于磺胺类抗生素的抗菌谱较广，毒副作用轻，对常见细菌、螺旋体和某些放线菌均能表现出抑制作用，被广泛应用于畜牧生产各环节[8]。其他种类的抗生素还有，比如恩诺沙星、阿奇霉素、林肯霉素，氨苯磺胺等，但有关各种抗生素在稀释精液中的抑菌效果还有待进一步研究。

2 稀释液的添加物质

在常温保存的过程中，精液质量还受到微生物、过氧化物浓度、抗氧化能力以及其他精子保护成分的影响。精液的稀释液主要为精子提供一个稳定的体外生存环境，维持精子各项功能的正常。常见的稀释液BTS和Modena中都含有能量物质、缓冲物质、无机盐、抗生素等组分，来为精子提供能量、合适的pH、合适的渗透压、合理的离子浓度以及相对无菌的环境。有研究发现，在猪精液的3种稀释液Modena、BTS、GEPS中保存效果较好的是Modena[9]。

人们还向稀释液中添加其他成分如抗氧化剂，以及其他种类的保护成分来进一步保证精子活力以及受精能力。

2.1 无机盐离子

一些离子对精子的存活和功能是必需的。较低浓度的K+可维持精子膜上Na+—K+泵运转,使胞内K+浓度大于胞外，产生ATP维持精子的存活和运动，因此在稀释液中添加KCl可防止精子耗竭K+而丧失运动能力。还有一些离子不利于精子保存，如有缓冲作用的HCO3-，若过量就会使精子质膜结构改变，使质膜不稳定诱发获能，因此需要控制浓度。Ca2+跨膜流入胞内会启动精子获能,引起顶体反应，这对完成受精是必需的，但对保存却是有害的。因此,配制稀释液常用去离子水，并加入EDTA等鏊合Ca2+和有害重金属离子。

2.2 抗氧化剂

在精液的常温保存过程中，精子呼吸代谢会产生活性氧族（ROS），低浓度的ROS有利于提高精子的活力以及受精能力，但高浓度的ROS会造成精子脂质的过氧化（LOP），改变精子质膜的通透性，这会降低精子的活力以及受精能力。所以常在精液的稀释液中添加抗氧化剂成分来保证精子的活力以及受精能力。谷胱甘肽（GSH）是一种三肽化合物，可以抑制质膜上脂质的过氧化。VB12、VE、VC、大枣多糖和葡萄籽原花青素，也都具有抗氧化的作用。有研究表明，在猪的精液稀释液中添加1 mmol/L的谷胱甘肽对精液有较好的保护效果，而添加1和5 mmol/L的维生素E对精液常温保存有害的效果[10]。而添加400 μmol/L的维生素E可以显著降低保存4 d精液中MDA的含量[11]。在猪精液的稀释液中添加适量的褪黑素可以提高精液的抗氧化能力和精子运动学参数，保护精子质膜、顶体和DNA 完整性，提高精子的受精能力[12]。

2.3 精子质膜保护剂

精子的质膜完整性对于维持精子自身的新陈代谢、精子获能以及顶体反应等都起着至关重要的作用。海藻糖作为一种非渗透性保护剂，能够在精子的细胞膜外形成一层保护膜，从而保护质膜的完整性。同时，海藻糖还具有稳定细胞膜蛋白质的作用。稀释粉配方的设计者认为，海藻糖在极冷环境下可以保护精子的质膜，在常温下对精子的质膜同样能起到保护作用，该配方通过添加 1 g 海藻糖，使保存 7 d 精液的顶体异常率由原来的20%下降到11%。高建明等[13]，在自己设计筛选的100 ml稀释液中额外添加 0.15 g海藻糖，显著提高了精液的保存时间，其保存效果要优于添加维生素B12组。精子长效稀释液中添加AEG和SCP可以有效降低精子代谢活性以及保护精子质膜完整性[14]。除海藻糖之外，其他一些糖类同样能对精子的膜结构起到一定的保护作用，如蔗糖、果糖等。

2.4 抗菌素

精液保存液中细菌会降低精液的保存时间，使精子更易反生凝集，使pH下降，使顶体发生异常的情况增加，并在保存的第2天就有体现。应用后会导致母猪的返情率升高，阴道内分泌物增多，增加母猪阴道的感染机率，从而增加母猪的淘汰率[6]。由于抗生素的不正确使用，导致细菌的耐药性不断增强，所以急需研制一种抗生素的替代品，这种替代品不会使细菌产生耐药性，因此抗菌肽进入了人们的视线。抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2 000～7 000 D左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，但部分抗菌肽对真核生物有一定的毒副作用[15]。有研究发现，在BTS保存液添加低浓度的环状六肽比使用抗生素的对照组要好，并且将添加有低浓度的环状六肽的精液通过人工授精技术输入到母猪的子宫内，其受胎率不会受到影响，发现这种环状六肽可以作为补充或替换保存液中的抗生素[16]。

2.5 其他保护成分

牛血清白蛋白（BSA）是一种蛋白类保护剂，具有稳定精子结构，中和精子有害代谢产物，维持精子运动和减少精子凝集等多种功能，从而起到延长精液保存时间，提高保存后精液的受精能力的作用。在精液稀释液中添加4 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA），其精液的保存效果最好[17]。但BSA在较高浓度下会导致精子的获能，所以添加时一定注意用量。

中草药作为我国医药的瑰宝在猪精液的保存方面也有一定的应用。在猪精子常温保存和降温过程中白藜芦醇对精子具有一定的保护作用，能够清除猪精子内的活性氧自由基，减弱氧自由基对精子的损伤,提高精子的品质。在常温保存中最佳保护浓度为50μmol/L[18]。有研究发现,中草药何首乌，其主要活性成分TSG是重要的抗氧化剂，具有增强免疫力、抗氧化损伤和抗衰老等作用，也可应用在猪精液保存方面。但由于许多中草药的成分并不明确，以及添加剂量可能随草药产地的不同而不同，所以具体的应用还有待进一步的研究。但随着科技的发展以及中草药低温萃取技术的不断完善，相信在不久的将来中草药将发挥越来越重要的作用。

3 结语及展望

猪精液的液态保存经过几十年发展, 应用已经非常的广泛，为我国现代养猪行业的发展做出重要的贡献。相信随着科技进步以发展以及相关学者的不断研究探索，猪精液常温液态保存技术将向保存长久、价格便宜、高效的方向发展。

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S828.3

A

1005-2739（2017）01-0003-05

2016-12-09

黑龙江省农垦总局科研计划项目（编号：HNK135-04-06；HNK135-04-02-03）；国家自然科学基金项目（No.31402136）；黑龙江八一农垦大学博士启动基金（B2012-06）；黑龙江省自然科学基金资助项目（JJ2017ZR0120）；大庆市指导性科技计划项目（zd2016-087）。

李琦（1992-），男，在读硕士研究生。

＊通信作者：魏国生，男，教授。李井春，男，博士，讲师，研究方向为动物繁殖生物技术。E-mail：ljchun112@163.com