miRNA-21减轻氧糖剥夺对PC12细胞的损伤*

余 舰， 张 扬， 晁迎九， 高 歌， 陈 昱， 顾大群

(安徽省立医院神经外科，安徽省脑立体定向神经外科研究所，安徽 合肥 230036)

miRNA-21减轻氧糖剥夺对PC12细胞的损伤*

余 舰△， 张 扬， 晁迎九， 高 歌， 陈 昱， 顾大群

(安徽省立医院神经外科，安徽省脑立体定向神经外科研究所，安徽 合肥 230036)

目的： 探讨微小RNA(miRNA)-21对低氧缺血损伤PC12细胞的影响。 方法：体外培养PC12细胞，建立氧糖剥夺(OGD)损伤模型。细胞随机分为对照组、OGD组、阴性对照序列+OGD组、miRNA-21 inhibitor+ OGD组和miRNA-21 mimic+OGD组。通过采用CCK-8、real-time PCR、Western blot等技术探讨miRNA-21对OGD损伤PC12细胞的影响和机制。 结果：降低miRNA-21的表达，受OGD损伤的PC12细胞活力明显下降；增加miRNA-21的表达，受OGD损伤的PC12细胞活力明显增加。进一步发现miRNA-21促进OGD损伤PC12细胞的AKT磷酸化。 结论:miRNA-21明显增加OGD损伤PC12细胞的活力，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。

微小RNA-21； PI3K/AKT信号通路； 氧糖剥夺； PC12细胞

脑血管疾病一直是危害我国中老年人身体健康和生命安全的主要疾病，其中以缺血性卒中最为常见，发病比例约70%，在缺血性卒中的病理生理学过程中，低氧缺血是造成脑组织损伤的主要因素。已知微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为20～24个核苷酸的内源性非编码小RNA，在转录水平负性调控基因的表达[1]。而前期研究对缺血缺氧后大鼠大脑切片行miRNA基因芯片分析的结果提示缺血缺氧处理后miRNA-21表达量显著上调[2]。本研究借助氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)造成的低氧缺糖损伤细胞模型，探讨miRNA-21对受血损伤的PC12细胞的保护作用。

材 料 和 方 法

1 材料

PC12细胞购自上海细胞库；DMEM和胎牛血清(Gibco)；LipofectamineTM2000及TRIzol(Invitrogen)；SYBR Green Master Mix(TaKaRa)；CCK-8试剂盒(Dojindo)；抗p-AKT (Ser-473)、p-AKT (Thr-308) 多克隆抗体和AKT抗体(Cell Signaling Technology)；抗β-actin抗体(Sigma)。

2 方法

2.1 细胞培养及分组 PC12细胞置于高糖DMEM(含10%胎牛血清、10 mmol/L HEPES和2 mmol/L谷氨酸)，37 ℃、5% CO2状态下培养。细胞随机分为5组：对照组：仅进行常规培养；OGD组：无糖低氧条件下培养12 h；阴性对照(negative control, NC)+OGD组：瞬时转染NC序列24 h后，无糖缺氧条件下培养12 h；miRNA-21 inhibitor+OGD组：瞬时转染miRNA-21抑制物24 h后，无糖缺氧条件下培养12 h；miRNA-21 mimic+OGD组：瞬时转染miRNA-21模拟物24 h后，无糖缺氧状态下培养12 h。转染过程根据LipofectamineTM2000说明书进行。

2.2 Real-time PCR检测miRNA-21的表达 各组依照实验设计要求，按TRIzol说明书抽取总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度，茎环法转录得到cDNA。采用SYBR Green法检测各组miRNA-21的表达量，引物序列如表1所示。扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，55 ℃ 30s ，72 ℃ 90s，35～40个循环。每个样品重复3次。

表1 Real-time PCR的引物序列

2.3 CCK-8法测定细胞活力 将PC12细胞以5×107/L密度接种于96孔板，每孔50 μL。于37 ℃、5% CO2条件下培养过夜，并依照实验要求每孔加CCK-8试剂10 μL，继续培养4 h，用酶联免疫仪在波长450 mm处读取吸光度。

2.4 Western blot检测PI3K/AKT信号通路的激活 将PC12细胞接种于6孔板，按实验要求给予后，加入细胞裂解液，4 ℃裂解30 min，取蛋白液，采用BCA法进行蛋白定量，总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移到硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，随后加入抗p-AKT、AKT和β-actin抗体(1∶1 000)，4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，加入相应HRP标记的IgG，室温2 h，加显色试剂显影、曝光，图像分析软件分析结果。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组之间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miRNA-21表达量的检测

Real-time PCR检测各组miRNA-21的相对表达量，结果如图1所示。和对照组相比，OGD组的miRNA-21表达明显增加(P<0.05)；转染miRNA-21 mimic后miRNA-21的表达进一步明显增加(P<0.05)；而miRNA-21 inhibitor+ OGD组与对照组比较无明显差异。

Figure 1.The relative expression levels of miRNA-21 in the PC12 cells with different treatments detected by real-time PCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图1 Real-time PCR检测各组miRNA-21 的相对表达量

2 miRNA-21表达上升可增加低氧缺血PC12细胞的活力

如图2所示，与对照组相比，OGD组PC12细胞活力明显下降34.9%(P<0.05)；与OGD组相比，miRNA-21 inhibitor+ OGD组细胞活力下降44.8%(P<0.05)；与OGD组相比，miRNA-21 mimic+ OGD组细胞活力上升37.7%(P<0.05)。

Figure 2.The viability of the PC12 cells in each group detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05 control group;#P<0.05vsOGD.

图2 CCK-8法检测各组PC12细胞的活力

3 miRNA-21激活PI3K/AKT相关的信号通路

如图3所示，OGD处理及转染miRNA-21 inhibitor或mimic对总AKT表达无明显影响；与对照组相比，降低miRNA-21表达抑制了OGD处理对PI3K/AKT信号通路的激活，但差异无统计学意义，而增加miRNA-21表达则进一步增强低氧缺糖处理对PI3K/AKT信号通路的激活(P<0.05)。这些结果表明miRNA-21在低氧缺糖状态下PC12细胞的PI3K/AKT信号通路激活过程中起着关键作用。

Figure 3.The effects of miRNA-21 on the activation of PI3K/AKT signaling pathway under hypoxia and glucose deprivation condition detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsOGD.

图3 Western blot法检测低氧缺糖损伤状态下miRNA-21对PI3K/AKT信号通路激活的影响

讨 论

低氧缺糖损伤是神经组织常见的损伤形式，可激发体内多种应激机制修复损伤而保护脑组织[3]，在我们的前期研究中，胰岛素样生长因子1分泌增加，及低氧诱导因子1α 和葡萄糖转运蛋白3表达上调均参与其保护机制[4-5]。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞株，具有合成、代谢及运输神经递质的特性，长期被广泛用于研究中枢神经系统疾病的体外模型。动物体内成熟的单链miRNA先与一种核糖核蛋白结合形成复合物，再引导复合物结合到靶mRNA的3’-UTR，进一步抑制mRNA的翻译从而在转录水平负性调控基因的表达[6]。在外周和中枢神经系统疾病如脑卒中的发病和潜在治疗应用过程中miRNA的作用的已经被广泛关注[7-11]。前期研究对缺血缺氧后大鼠大脑切片行miRNA基因芯片分析，结果提示缺血缺氧前后某些miRNA表达量显著改变，包括miRNA-21、miRNA-34a、miRNA-30d和miRNA-9等[2, 12]。在神经胶胶质瘤细胞中发现miRNA-21表达水平增加5～100倍，抑制miRNA-21表达后caspase-3活性增加，胶质细胞凋亡增加[13]，表明miRNA-21与细胞凋亡密切相关，最后我们将目标锁定于miRNA-21。

本实验通过建立PC12细胞的OGD模型，并通过转染miRNA-21抑制剂或模拟物，发现低氧缺糖状态下同时抑制miRNA-21表达进一步降低细细胞活力，而miRNA-21过表达可增加低氧缺糖状态下细胞活力。这些结果提示miRNA-21对保护低氧缺糖状态下的PC12细胞起着重要的作用。本研究进一步探讨miRNA-21保护低氧缺糖状态下的PC12细胞的具体机制。

miRNA-21可参与多种信号通路的激活，有报道表明miRNA-21可通过激活PI3K/AKT信号通路保护缺血再灌注的心肌细胞[14]，同时我们先前的研究证明PI3K/AKT信号通路在保护低氧缺血损伤脑组织起着重要作用[4]，但miRNA-21是否通过相同机制保护低氧缺糖损伤脑组织仍不明确。进一步研究发现降低miRNA-21表达抑制了低氧缺糖处理对PI3K/AKT信号通路的激活，而增加了miRNA-21表达则进一步增强低氧缺糖处理对PI3K/AKT信号通路的激活，这些结果表明miRNA-21在低氧缺糖状态下PC12细胞的PI3K/AKT信号通路激活过程中起着关键作用。但miRNA-21激活PI3K/AKT信号通路后的下游相关蛋白及机制仍不明确，将是我们下一步研究的重要方向。综上所述，在本研究中我们将miRNA-21调控的PI3K/AKT信号通路保护低氧缺血损伤PC12细胞的作用机制作为主要解决的科学问题，研究成果有望为进一步推动药物保护低氧缺血损伤脑组织新的靶点提供更充分理论依据。

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(责任编辑： 卢 萍， 罗 森)

Effect of miRNA-21 on protection of PC12 cells from oxygen-glucose deprivation damage

YU Jian, ZHANG Yang, CHAO Ying-jiu, GAO Ge, CHEN Yu, GU Da-qun

(DepartmentofNeurosurgery,AnhuiProvincialHospital,BrainStereotacticNeurosurgeryInstituteofAnhuiProvince,Hefei230036,China.E-mail:yujianqi024@163.com)

AIM: To investigate the effect of microRNA (miRNA)-21 on the PC12 cells with hypoxic-ischemic damage.METHODS: The PC12 cells were culturedinvitro, and the cell model of oxygen-glucose deprivation (OGD) was established. In accordance with the following requirements, the cells were randomly divided into control group, OGD group, negative control sequence+OGD group, miRNA-21 inhibitor+OGD group and miRNA-21 mimic+OGD group. The effects and mechanism of miRNA-21 on the protection of PC12 cells from OGD damage were determined by CCK-8 assay, real-time PCR and Western blot.RESULTS: Decrease in the expression of miRNA-21 by transfection with miRNA-21 inhibitor inhibited the viavility of the PC12 cells subjected to OGD damage. Increase in the expression of miRNA-21 by transfection with miRNA-21 mimic promoted the viability of the PC12 cells subjected to OGD damage. It was further confirmed that miRNA-21 promoted the AKT phosphorylation in OGD-damaged PC12 cells.CONCLUSION: miRNA-21 significantly increases the viability of PC12 cells subjected to OGD damage, which may be related to the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

MicroRNA-21; PI3K/AKT signaling pathway; Oxygen-glucose deprivation; PC12 cells

1000- 4718(2017)02- 0361- 04

2016- 09- 02

2016- 11- 28

安徽省自然科学基金资助项目(No. 1508085QH174)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.028

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0551-62284074; E-mail: yujianqi024@163.com