母婴分离动物研究及其进展

张宇翔，刘建鹏，陈佳欣，张雪琴

(1.广州医科大学卫生管理学院，广东 广州 511436；2.南方医科大学附属顺德第一人民医院心理科，广东 顺德 528300)

母婴分离动物研究及其进展

张宇翔1，2，刘建鹏1，陈佳欣1，张雪琴1

(1.广州医科大学卫生管理学院，广东 广州 511436；2.南方医科大学附属顺德第一人民医院心理科，广东 顺德 528300)

早年养育环境及生活经历对个体成年后的影响日益受到重视，大量证据表明生命早期的逆境或不良应激事件会影响到人和动物长期的认知、心理和行为，也会增加个体成年后患精神疾病的风险。近年来，研究者运用母婴分离动物模型来探讨早期负性事件相关的子代成年后心身疾病的发病机制。本文将对母婴分离动物模型的研究方法及母婴分离所致成年后异常认知和行为的潜在机制进行阐述。

母婴分离；动物模型；身心影响；神经递质变化；药物成瘾

临床研究表明，生命早期是个体中枢神经系统发育的关键时期，该时期的养育环境及生活经历对中枢神经系统的正常发育起着重要作用。近年来，个体早期生活的负性刺激如社会剥夺、创伤与逆境、形式上的被忽视甚至虐待等对个体发展产生的影响，成为公共卫生关注的焦点。早期生活忽视动物模型可以探究早期负性刺激所引起的行为和神经生物学变化的潜在机制。

1 母婴分离动物模型及其研究程序

1.1 母婴分离动物模型 新生的哺乳类动物在一段时间内都由母亲照顾并与母亲保持密切相互作用，母亲为幼崽提供如营养、热量和感知觉刺激等重要资源。母亲的存在及其行为对其后代的情绪情感控制、认知和行为塑造以及生理反应的发展产生深远影响[1-2]。而母婴分离会引起后代生理和神经递质功能的紊乱，从而导致持久的情感相关行为变化和压力反应[3]。锯齿类动物母婴分离模型是一种早期社会剥夺模型，它的环境剥夺方式是出生后至断乳前的母婴分离。目前，该模型被认为是母婴分离对子代行为及神经发育影响研究的最有效模型之一。对大鼠的研究认为，在大鼠断奶前(出生后1～21 d)每天短暂地将母鼠和仔鼠分开3～15 min(称为“早期处理”)，这段间隔等同于正常情况下母鼠离开幼鼠外出觅食以及其他行为活动的时间，因此不会构成严重的早期亲子社会环境剥夺[4]；而将母鼠和仔鼠断奶前分离的时间延长至1 h，甚至更久(1～24 h)，则可以代表早期亲子社会环境被严重剥夺[5]。研究表明，在出生后经历过长时间母婴分离(3 h或3 h以上)的幼鼠，其成年后会出现行为认知的障碍，比如空间知觉障碍、焦虑样行为反应、学习记忆能力减退等。

1.2 母婴分离动物研究程序

1.2.1 分离时机 母婴分离通常从产后第2天开始到第10天或第14天，在一些实验中甚至持续到第21天[6]。母婴分离时间覆盖了焦虑压力反应期。焦虑压力反应期是指正常环境下成长的幼鼠在出生后两周内，其肾上腺皮质会表现出对压力刺激的反应低甚至无反应的现象[7]。这种自然形成的抗压抗焦虑的能力也许在母婴分离过程中被削弱。

1.2.2 分离频率 母婴分离包括连续重复分离和单次分离。在大部分实验中，连续重复分离较为常见，一般是1次/d或2次/d；如为单次分离，则为一段长时间的母婴分离。

1.2.3 分离持续时间 在不同的实验室，母婴分离时间长短亦不同，为避免混乱，大部分模型使用“MSxx”代码，MS(maternal separation)指母婴分离，xx代表分离持续时间，以分钟为单位。在某些实验中，分离时间长达24 h(MS1440)。

1.2.4 对照组 没有母婴分离的幼鼠自然是理想的对照组，其饲养条件也应该遵循动物饲养设施培养要求(animal rearing facility conditions，ARF)，包括它们的笼子应每周清洁2～3次。但是，大部分非母婴分离幼鼠都在环境较差的地方培育，而母婴分离处理的幼鼠通常在舒适的环境中培育，舒适环境对幼鼠成长发育又有一定的积极影响[8]。为了更好的反映自然生存环境，排除不同生长环境对幼鼠发育的影响，国内外大部分研究都会对幼鼠进行“早期处理”，即每天短暂地将母鼠和仔鼠分开3～15 min(MS3-MS15)，经历过这种处理的幼崽被认为是MS180的最佳对照组，此短时间的分离能模拟母鼠离开幼崽外出觅食的情况。但也有研究发现短时间母婴分离的幼崽比长时间分离的更容易焦虑[9]，所以对照组的选择标准有待进一步的研究。国外一些研究在选择对照组时，也并未进行MS3-MS15这种简单处理而只选择达到ARF要求的幼鼠作为对照组。目前，经历过MS3-MS15处理的幼鼠和ARF幼鼠之间是否存在统计学上的差异，尚无明确定论。母婴分离的影响也会因为幼崽单独分离抑或配对分离、性别有所不同。

1.3 母婴分离动物行为学实验测试范式 经历母婴分离的幼崽成年后表现出前脉冲抑制缺失、潜伏抑制缺失、颠倒学习能力降低以及社会行为减少等行为，可以通过相关的实验测试范式反映这些变化[10]。以下是3个比较常见的动物行为实验测试范式。

1.3.1 高架十字迷宫 高架十字迷宫的原理是利用啮齿类动物对新异环境的探究行为和对高悬着的开臂的恐惧，造成其内心的矛盾冲突，设计出具有两个开臂和两个闭壁的十字迷宫，通过抬高迷宫增加动物进入开臂时的恐惧，以此来评价实验中各组动物的焦虑状态。实验发现，母婴分离大鼠进入开放臂的次数明显少于正常大鼠，且停留的时间也要短于正常大鼠，表明母婴分离可能会诱导大鼠成年后的焦虑行为反应[11]。

1.3.2 旷场实验 旷场实验是以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率、持续时间以及动物尿便次数等评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。利用旷场实验对母婴分离动物的研究发现，与对照组相比，出生后第9天与母亲分离24 h的大鼠以及出生后前2周，3～5 h母婴分离的大鼠在成年阶段焦虑水平均显著增加[7]；此外，雌性动物母婴分离对动物焦虑状行为的影响与其发情期密切相关，推断雌性激素水平与母婴分离后焦虑状行为存在一定的相互作用。

1.3.3 Morris水迷宫 Morris水迷宫主要用于测试动物对空间位置觉和方向觉的学习记忆能力。研究者利用水迷宫测验探索了母婴分离对逆反学习能力的影响。逆反学习能力是一种能够根据周围环境的变化迅速调整自身行为模式的能力，它反映了认知的灵活性。Sousa等[12]的研究发现早期母婴分离会使成年大鼠的逆反学习能力受损；而其他研究发现，出生后第4天、第9天或者第18天分别进行的24 h的母婴分离可引起成年大鼠逆反学习能力的显著提高[13]。

2 母婴分离对动物产生的影响

2.1 母婴分离对动物认知和行为的影响 母婴分离不仅影响个体的记忆发展、肠道吸收，还会导致动物成年后更易出现焦虑样行为、攻击行为和成瘾行为。

2.1.1 母婴分离对动物的记忆的影响 早期母婴分离的幼鼠在长时程空间记忆测试中表现出学习延迟，在短时程空间记忆测试中有显著缺损。Lei等[14]研究发现，早期经历过母婴分离的成年鼠也表现出记忆缺失及学习功能缺损。早期的母婴分离也可导致幼鼠成年后出现癫痫症状，尤其是雌性幼鼠表现出持久的癫痫易损性，进而发生行为异常和记忆障碍。

2.1.2 母婴分离所致动物成年后焦虑样反应初生幼崽的大脑发育水平相当于人类23～24周的胎儿，其最初2周是神经发育和髓鞘生长的重要时期，包括温度调节、营养供给、排尿刺激、免疫防御等方面都依赖于母亲。初生后的10 d内，母亲的舔舐和梳理皮毛能降低下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)对外界刺激的反应[15]。这段时期HPA低反应性有助于个体的生长发育以及中枢神经系统成熟，也有助于成年期动物的正常应激反应的建立。而母婴分离应激会造成HPA轴出现不同程度的功能障碍，这一效应可以持续至成年。相关研究证实，母婴分离后幼崽虽然HPA轴对压力的反应在产后一段时间内处于相对静止状态，但是其高反应性依然存在[16]。如果将母鼠和幼崽进行彻底的母婴分离(如人工喂养)能诱导幼崽成年期的抑郁或焦虑表现[17]；Oomen等[18]的试验证实了这一点，经历了母婴分离的幼崽，其脑内海马对HPA轴的抑制调节功能失效，从而导致其成年后出现焦虑样行为。

2.1.3 母婴分离与肠道易激综合征 肠道易激综合征是一种反复发作的腹痛/腹部不适伴排便习惯的改变的疾病。越来越多的证据表明母婴分离所致的神经、内分泌、炎症及代谢调控网络紊乱会造成肠道黏膜损伤和防御机制失衡，肠道屏障功能下降，导致肠道易激综合征。新生期母婴分离可导致大鼠肠道感觉运动性调节能力异常，表现为对成年后期应激刺激更为易感。Kinnally等[19]研究发现，肠道易激综合征患者发病急性期5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量显著高于缓解期，而缓解期的含量仍明显高于对照组，说明5-HT浓度增高是内脏感觉超敏化发病机制的关键环节。也有一些研究表明，新生期母婴分离使大鼠结直肠扩张后结肠黏膜5-HT表达显著增加，使其成年后对伤害性刺激的神经反应增强。

2.1.4 母婴分离与药物成瘾的关系 母婴分离会导致成年后酒精摄入量的增加、吸食过量的可卡因以及更加容易对药物成瘾。目前，母婴分离引起这些行为的机制尚不明确，药物成瘾的“动机显著”假说认为，药物成瘾与多巴胺奖赏环路密切相关。前额皮层接受来自于中脑腹侧被盖区的多巴胺，同时会将致密体传递到伏膈核，以此来调节和控制动机归因、决策以及介导觅药行为。相关研究证实，母婴分离会导致成年后前额皮层与伏隔核中的树突增长及树突棘密度增大[20]，影响前额皮层中多巴胺受体的表达，使得动机控制减弱，导致成瘾行为。据研究统计，在药物成瘾的人群当中，有1/2～2/3的人，他们在生活的早期都经历过不良生活事件[21]。

2.2 母婴分离动物的神经递质变化 早期母婴分离会导致子代的神经递质发生异常变化，直接或间接诱发心理状态及行为问题。

2.2.1 5-羟色胺 5-HT涉及大脑活动的许多方面，不仅可以调节情绪，还对记忆力、精神活力甚至人生价值观的塑造等产生作用。母婴分离可引起大脑5-羟色胺系统相关分子的改变。研究发现，与对照组成年鼠相对比，母婴分离组大鼠成年后海马CA1区的5-羟色胺受体(5-HT1A和5-HT1B)含量明显增加，5-羟色胺受体水平显著增高；且中缝背核中的5-HT和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)水平均显著高于对照组大鼠[22]。母婴分离可能使个体的大脑对5-HT系统的自我调节机制发生紊乱，从而在其成长发育过程中压力增加时容易出现情绪调节问题和成瘾问题。

2.2.2 多巴胺 已有的研究表明，处于急性应激反应状态时，母婴分离大鼠下丘脑内DA水平会明显的增加，这种显著的变化并没有出现在对照组大鼠。经历过母婴分离的动物，它们大脑伏隔核内多巴胺代谢的产物高香草酸水平显著高于对照组动物[23]。与对照组动物相比，母婴分离大鼠对多巴胺激动剂安非他明及阿扑吗啡的行为反应显著增高[24]。而安非他明能导致产生某些类似精神样障碍的症状。

2.2.3 肾上腺皮质激素 肾上腺皮质激素的分泌主要是受到HPA轴的调节。体内HPA轴被激活时，肾上腺皮质激素释放水平明显升高。HPA轴维持着内部稳态与应激反应的应答，它的异常激活状态会使大鼠出现抑郁焦虑样行为。Brummelte等[25]研究发现，幼鼠出生后与母鼠每天分离3～6 h，持续14 d，结果显示母婴分离组血清的皮质酮与促肾上腺皮质激素水平显著增高。而经历过母婴分离的大鼠成年后，其下丘脑内的促肾上腺皮质激素释放因子(CF)mRNA的基线水平显著增高，对外界刺激会表现过度敏感[26]。除了上述三类生理生化指标的变化外，母婴分离也可造成机体内其他因子的异常分泌，直接或间接诱发心理状态及行为的异常。例如：新生期经历母婴分离后的幼鼠体内含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)被激活，其中Caspase-3的表达显著增强[27]；Caspase是细胞凋亡的重要执行因子，Caspase-3的超活化被看作是细胞凋亡的重要早期标志。因此，新生期母婴分离可致使海马神经元细胞凋亡明显增多，进而对幼鼠中枢神经系统的发育构成严重损伤。Merali等[28]研究发现，从大鼠第三脑室注射神经肽nesfatin-1后，大鼠会表现出明显的恐惧及焦虑行为；母婴分离相关性研究中，均可发现母婴分离组大鼠血浆nesfatin-1水平的升高。

3 展 望

综上所述，母婴之间相互作用的环境会对子代成长过程中的生理表达、心理活动变化及行为的塑造产生深远的影响。虽然大量的研究已经表明，母婴分离与子代成年后某些认知、行为、情绪的异常具有相关性，但影响的相关机制尚不明确，仍有待进一步研究。另外，对人类个体的研究发现，母婴分离会对母亲的再次养育愿望、情绪和行为等产生重要影响，而目前更多动物研究集中在母婴分离对子代产生的影响，母婴分离对母亲的影响仍有待进一步探讨。母婴分离的动物实验研究虽然不能完全模拟人类母婴分离的社会情境和中枢发育变化，但可以为人类个体的母婴分离研究提供更多的参考。此外，母婴分离是否在也会对基因层面的表达产生重要影响也需要进一步探讨。

[1]Eklund MB,Johansson LM,Uvnas-Moberg K,et al.Differential effects of repeated long and brief maternal separation on behaviour and neuroendocrine parameters in Wistar dams[J].Behav Brain Res, 2009,203(1):69-75.

[2]孙鸿燕,朱小霞,董文斌,等.新生期母婴分离对大鼠成年后行为的影响及机制[J].中国妇幼保健,2011,26(19):2984-2986.

[3]Millstein RA,Holmes A.Effects of repeated maternal separation on anxiety-and depression-related phenotypes in different mouse strains [J].Neurosci Biobehav Rev,2007,31(1):3-17.

[4]Liu D,Diorio J,Tannenbaum B,et al.Maternal care,hippocampal glucocorticoid receptors,and hypothalamic-pituitary-adrenal responses to stress[J].Science,1997,277(5332):1659-1662.

[5]Guilarte TR,Opler M,Pletnikov M.Is lead exposure in early life an environmental risk factor for schizophrenia?Neurobiological connections and testable hypotheses[J].Neurotoxicology,2012,33(3): 560-574.

[6]Xiong GJ,Yang Y,Cao J,et al.Fluoxetine treatment reverses the intergenerational impact of maternal separation on fear and anxiety behaviors[J].Neuropharmacology,2015,92(1):1-7.

[7]Vetulani J.Early maternal separation:a rodent model of depression and a prevailing human condition[J].Pharmacological Reports Pr, 2013,65(6):1451-1461.

[8]Peter Kiss KSGH.Gender-dependent effects of enriched environment and social isolation in ischemic retinal lesion in adult rats[J].International Journal of Molecular Sciences,2013,14(8):16111-16123.

[9]Aguggia JP,Suárez MM,Rivarola MA.Early maternal separation: neurobehavioral consequences in mother rats[J].Behavioural Brain Research,2013,248(4):25-31.

[10]Thompson R.Impaired visual and spatial reversal learning in brain-damaged rats:additional components of the“general learning system”of the rodent brain[J].Physiological Psychology,2013,10 (3):293-305.

[11]Rentesi G,Antoniou K,Marselos M,et al.Long-term consequences of early maternal deprivation in serotonergic activity and HPA function in adult rat[J].Neurosci Lett,2010,480(1):7-11.

[12]Sousa VC,Vital J,Costenla AR,et al.Maternal separation impairs long term-potentiation in CA1-CA3 synapses and hippocampal-dependent memory in old rats[J].Neurobiology of Aging,2014,35(7): 1680-1685.

[13]Niwa M,Matsumoto Y,Mouri A,et al.Vulnerability in early life to changes in the rearing environment plays a crucial role in the aetiopathology of psychiatric disorders[J].International Journal of Neuropsychopharmacology,2010,14(4):459-477.

[14]Lei A,Zhang T.Comparison impairments of spatial cognition and hippocampal synaptic plasticity between prenatal and postnatal melamine exposure in male adult rats[J].Neurotoxicity Research, 2015,29(2):218-229.

[15]Bagot RC,Zhang TY,Wen X,et al.Variations in postnatal maternal care and the epigenetic regulation of metabotropic glutamate receptor 1 expression and hippocampal function in the rat[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012,109 Suppl 2:17200-17207.

[16]Rees SL,Akbari E,Steiner M,et al.Effects of early deprivation and maternal separation on pup-directed behavior and HPA axis measures in the juvenile female rat[J].Dev Psychobiol,2008,50(4):315-321.

[17]Colonnello V,Iacobucci P,Panksepp J.Analysis of the disruption of maternal social bonds in octodon degus:separation distress in restricted reunion tests[J].Developmental Psychobiology,2011,53(7): 657-669.

[18]Oomen CA,Soeters H,Audureau N,et al.Early maternal deprivation affects dentate gyrus structure and emotional learning in adult female rats[J].Psychopharmacology,2011,214(1):249-260.

[19]Kinnally EL,Tarara ER,Mason WA,et al.Serotonin transporter expression is predicted by early life stress and is associated with disinhibited behavior in infant rhesus macaques[J].Genes Brain&Behavior,2010,9(1):45-52.

[20]Brenhouse HC,Sonntag KC,Andersen SL.Transient D1 dopamine receptor expression on prefrontal cortex projection neurons:relationship to enhanced motivational salience of drug cues in adolescence [J].J Neurosci,2008,28(10):2375-2382.

[21]Dube SR,Felitti VJ,Dong M,et al.Childhood abuse,neglect,and household dysfunction and the risk of illicit drug use:the adverse childhood experiences study[J].Pediatrics,2003,111(3):564-572.

[22]Choy KH,de Visser Y,Nichols NR,et al.Combined neonatal stress and young-adult glucocorticoid stimulation in rats reduce BDNF expression in hippocampus:effects on learning and memory[J].Hippocampus,2008,18(7):655-667.

[23]Arborelius L,Eklund MB.Both long and brief maternal separation produces persistent changes in tissue levels of brain monoamines in middle-aged female rats[J].Neuroscience,2007,145(2):738-750.

[24]Hensleigh E,Pritchard LM.The effect of early environmental manipulation on locomotor sensitivity and methamphetamine conditioned place preference reward[J].Behavioural Brain Research,2014,268 (15):66-71.

[25]Brummelte S,Schmidt KL,Taves MD,et al.Elevated corticosterone levels in stomach milk,serum,and brain of male and female offspring after maternal corticosterone treatment in the rat[J].Developmental Neurobiology,2010,70(10):714-725.

[26]Fenoglio KA,Chen Y,Baram TZ.Neuroplasticity of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis early in life requires recurrent recruitment of stress-regulating brain regions [J].J Neurosci,2006,26(9): 2434-2442.

[27]Aisa B,Tordera R,Lasheras B,et al.Cognitive impairment associated to HPA axis hyperactivity after maternal separation in rats[J].Psychoneuroendocrinology,2007,32(3):256-266.

[28]Merali Z,Cayer C,Kent P,et al.Nesfatin-1 increases anxiety-and fear-related behaviors in the rat[J].Psychopharmacology(Berl), 2008,201(1):115-123.

Research progress on the animal model of maternal separation.

ZHANG Yu-xiang1,2,LIU Jian-peng1,CHEN Jia-xin1, ZHANG Xue-qin1.1.School of Health Management,Guangzhou Medical University,Guangzhou 511436,Guangdong, CHINA;2.Department of Psychology,the First People's Hospital of Shunde,Southern Medical University,Shunde 528300, Guangdong,CHINA

A lot of evidences show that early life stress or distress incident will affect the long-term human and animal cognition,psychology and behavior,and also will increase the individual spiritual adulthood risk of disease,so the effects of early rearing environment and life experiences on an adult get more attention.In recent years,researchers explore the pathogenesis of adulthood psychosomatic diseases related to aversive early life experiences with the animal model of maternal separation.The authors review the latest progress in the method of the animal model of maternal separation and the potential mechanisms of abnormal cognition and behavior in adults related to maternal separation.

Maternal separation;Animal model;Physical-mental effects;Changes of neurotransmitter;Drug addiction

R-332

A

1003—6350（2017）06—0943—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.028

2016-07-14)

国家自然科学基金(编号：31470990)

张雪琴。E-mail：gzzxq2005@126.com