miR-581对结直肠癌SW620细胞增殖能力的影响①

李龙梅 泮红飞 张 红 罗军敏 冯继红

(遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫学研究生教育创新基地，遵义563003)

miR-581对结直肠癌SW620细胞增殖能力的影响①

李龙梅 泮红飞 张 红 罗军敏 冯继红②

(遵义医学院免疫学教研室，贵州省免疫学研究生教育创新基地，遵义563003)

目的：探讨miR-581对结直肠癌SW620细胞增殖能力的影响。方法：分别用携带miR-581基因的慢病毒颗粒(LV-miR-581-GFP)和miR-581 mimics(miR-581)转染人结肠癌细胞株SW620作为实验组；用对照组病毒颗粒(LV-GFP)和对照组mimics (Vector)转染SW620细胞株作为阴性对照组。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞中miR-581的mRNA表达水平；CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖能力和克隆形成能力的变化。结果：实验组SW620细胞中miR-581表达较对照组明显增高(P<0.05)；CCK8和克隆形成实验显示过表达实验组细胞的增殖及克隆形成能力较对照组明显增强(P<0.05)。 结论：miR-581对结直肠癌SW620 细胞的增殖具有促进作用。

miR-581；结直肠癌；增殖

结直肠癌是世界上常见恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率逐年上升，2015年癌症统计报道，其每年新发病例130多万，死亡率49万多，严重威胁人类的健康[1]。尽管近年来结直肠癌治疗水平不断提高，但结直肠癌患者死亡率仍不断上升[2]。结直肠癌发病是一个多因素，多步骤的过程。因此，在分子水平揭示结直肠癌发生发展的机制，寻找新的靶分子治疗和干预结直肠癌的发生发展至关重要。

miRNAs是一类长度约22～24个核苷酸的非编码RNA，通过与靶基因的3′端结合调控靶基因的表达[3，4]。近年研究发现，多种miRNAs在结直肠癌中异常表达，miRNAs作为促癌基因或抑癌基因参与细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移等过程，与结直肠癌的发生发展密切相关[5]。miR-130b可以抑制结直肠癌细胞的增殖，促进凋亡[6]；miR-21通过靶向MARCKS对前列腺癌的增殖、侵袭和凋亡发生作用[7]。miR-581是新近发现的miRNA，有研究发现，miR-581在肝癌组织中低表达，且对肝癌细胞的生长具有促进作用[8]。在我们前期研究中，通过基因芯片筛查发现miR-581与结直肠癌的发生发展具有相关性。因此，本研究初步探讨miR-581对结直肠癌SW620细胞增殖及生长的影响，为进一步探讨miR-581在结直肠癌中所发挥的生物学功能作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 实验所选用SW620细胞株购自上海生命科学研究院细胞库；L-15培养基购自美国Gibco公司；慢病毒诱导表达载体购自上海吉凯基因；miR-581 mimics购自北京欧格林生物科技有限公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；细胞增殖检测CCK8试剂购自Sigam公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 结肠癌细胞株SW620选用L-15培养基，培养液中含10%FBS和1% PEST。培养条件为37℃、5%CO2，每2～3 d换液1次，当细胞数达长满培养瓶底部时，收集细胞。

1.2.2 慢病毒转染实验 将对数生长期的SW620细胞用胰酶消化，计数后均匀接种于6 孔板，分为2组：实验组(LV-miR-581)、空载慢病毒对照组(LV-NC) 。待细胞完全贴壁、细胞汇合率达60% 左右后进行转染，依次加入终浓度为8 μg/ml Polybrene、Eni.S、L-15 培养基及稀释的标准浓度病毒液( MOI 为100) ，使其总体积达1 ml，转染48 h 后在荧光显微镜下观察转染效果。

1.2.3 mimics转染实验 将对数生长期的SW620 细胞用胰酶消化，计数后均匀接种于6 孔板，分为2组：实验组(miR-581)、对照组(Vector)。待细胞完全贴壁、待细胞汇合率达到75%进行转染，用无血清培养基分别稀释Lipofectamine 2000(3 μl)、miR-581 mimics (5 μl)或对照组mimics(5 μl)。室温孵育5 min，将mimics和Lipofecta mine 2000混合，混匀后，37℃孵箱孵育20 min，分别加入细胞中，培养条件同上。

1.2.4 总RNA提取 用Trizol 法按说明书提取SW620细胞的总RNA，紫外分光光度计检测提取的总RNA 的纯度，要求A260/A280比值为1.8～2.0。

1.2.5 cDNA 合成和qRT-PCR 取1 μg总RNA行逆转录反应，miR-581逆转录体系及反应条件按试剂盒说明书操作。qRT-PCR反应体系及条件：Premix Ex Taq Version 2.0 10 μl，ddH2O 8 μl， cDNA 1 μl， 20×TaqMan Small RNA Assay 1 μl， 95℃预变性 5 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，45个循环。将扩增产物在4%的琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，确定扩增产物目的片段大小。采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。

1.2.6 CCK8法检测细胞增殖变化 参照CCK8试剂说明进行,分别取上述2组细胞以5×103孔-1的密度接种于96孔培养板(100 μl/孔)，37℃、5%的CO2条件下培养24 h后，加入10 μl CCK8继续孵育2 h后，用酶标仪在450nm波长下检测各孔的吸光度值。每隔24 h检测一次，每组设3个复孔，实验重复3次。

1.2.7 克隆形成检测克隆形成能力 分别取上述两组细胞以500/孔密度接种于6孔培养板(2 ml/孔)，37℃、5%的CO2条件下培养，2～3 d换液一次；15 d后PBS清洗细胞3次，10%甲醛固定30 min,结晶紫染色20 min，PBS清洗干净，镜下观察计数。

2 结果

2.1 miR-581慢病毒感染效果 慢病毒感染结肠癌SW620细胞后48 h，倒置荧光显微镜下观察感染效果，两组细胞荧光感染率均达到80%左右，见图1，qRT-PCR检测感染后SW620细胞miR-581表达，实验组(LV-miR-581)细胞miR-581的表达明显高于对照组 (LV-NC)细胞，差异具有统计学意义。

2.2 miR-581过表达对增殖的影响

2.2.1 CCK8实验结果 培养2 d时，两组细胞之间的增殖速度没有明显差异(P>0.05)，从第3天开始，实验组(LV-miR-581)细胞增殖速度明显高于对照组(LV-NC)细胞 (P<0.05)，见图2，实验结果表明，miR-581过表达可以增强SW620细胞的增殖能力。

2.2.2 克隆形成结果 实验组(LV-miR-581)细胞克隆数明显高于对照组(LV-NC)细胞(P<0.05)，见图3，表明过表达miR-581可以增强SW620细胞的克隆形成能力。

图1 慢病毒感染SW620细胞荧光表达情况及qPCR检测感染后miR-581表达Fig.1 Lentivirus infection of SW620 cells and GFP expression and expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote：*.P<0.05.

图2 miR-581过表达对SW620增殖能力的影响Fig.2 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

图3 过表达miR-581对SW620克隆形成能力的影响Fig.3 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote：**.P<0.01.

图4 qRT-PCR检测SW620细胞miR-581的表达Fig.4 Expression of miR-581 in SW620 cells were detected by qRT-PCRNote：*.P<0.05.

2.3 miR-581在结肠癌SW620细胞中转染效率测定 以上结果可以看出miR-581可促进细胞的增殖能力，为了进一步验证上述结果，用mimics转染SW620细胞，转染后48 h，qRT-PCR检测两组细胞miR-581的表达，实验组(miR-581)细胞miR-581的表达明显高于对照组(Vector)细胞(P<0.05)，见图4。

图5 过表达miR-581对SW620增殖能力的影响Fig.5 Effects of miR-581 overexpression on proliferation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

图6 过表达miR-581对SW620增殖能力的影响Fig.6 Effects of miR-581 overexpression on clone formation of SW620 cellsNote：*.P<0.05.

2.4 miR-581过表达对增殖的影响

2.4.1 CCK8结果 同miR-581慢病毒感染后结果相同，培养2 d时，两组细胞之间的增殖速度没有明显差异。从第3天开始，实验组(miR-581)细胞的增殖能力高于对照组(Vector)细胞(P<0.05)，见图5。进一步验证了上述结果，过表达miR-581可以促进SW620细胞的增殖能力。

2.4.2 克隆形成实验结果 与慢病毒结果相吻合，实验组(miR-581)细胞克隆形成率较对照组(Vector)细胞明显增高(P<0.05)，见图6。说明过表达miR-581可以促进SW620细胞的克隆形成能力。

3 讨论

结直肠癌发病率逐年上升，现居世界第三位。我国结直肠癌的发病率及死亡率也逐年增高，寻找新的靶基因是近年来肿瘤研究的热点。miRNA通过与靶基因的3′端结合，在转录后水平负性调控基因表达，近年研究发现，miRNA既可作为促癌基因，也可作为抑癌基因，介导肿瘤侵袭、转移、血管生成等多个病理过程，miRNA在肿瘤中的作用越来越受到人们的重视。例如，miR-21在结直肠癌中表达上调，并分别通过靶向调控PDCD4、TIAM1、SPRY2、PTEN、TGFBR2、CDC25A等分子促进结直肠癌的增殖、侵袭和转移等[9-13]；miR-224通过调节SMAD4促进结直肠癌的转移[14]；miR-27通过作用于VEGFR发挥抗肿瘤血管生成作用[15]；miR-126可下调乳腺癌中VEGF的表达而抑制其增殖和迁移能力[16]。

miRNA可调控多种基因，参与多条信号通路网的调控，在肿瘤的增殖中发挥关键作用。有研究发现miR-581在肝癌组织中表达下调，将miR-581 转染入人肝肿瘤细胞株HepG2.2.15 可显著促进细胞增殖，并可通过靶向Dicer 和EDEM1 促进HBsAg 的表达，认为在肝癌发生过程中下调miR-581可降低HBsAg 表达从而抑制肝细胞癌进展[8,17]。而关于miR-581在结直肠癌进展中的作用没有相关报道。本研究分别将miR-581的慢病毒载体和miR-581转染入SW620细胞，经qRT-PCR检测发现两种方法均使SW620细胞高表达miR-581，并且发现两种方法都显示过表达miR-581组细胞增殖较对照组增强，克隆数目较对照组增多，促进细胞生长，表明miR-581可促进SW620细胞的增殖能力。

本研究初步证实了miR-581过表达对结直肠癌的增殖具有促进作用。然而， miRNA在肿瘤调控机制中复杂，且细胞的增殖也是由多种基因进行调控，所以，miR-581调控肿瘤增殖具体是通过哪个靶基因，其促进肿瘤生长的机制具体又是什么，这些问题都有待深入研究。在以后的研究中我们将继续对其促增殖的具体机制及在结直肠癌侵袭转移中的作用进行研究，全面了解miR-581在结直肠癌发生发展中的生物学作用，为下一步的研究奠定基础。

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[收稿2016-07-25 修回2016-09-21]

(编辑 许四平)

Effects of miR-581 overexpression on proliferation of human colorectal cancer SW620 cells

LILong-Mei，PANHong-Fei,ZHANGHong,LUOJun-Min,FENGJi-Hong.

DepartmentofImmunology,ZunyiMedicalCollege,BaseforGraduateEducationinGuizhouProvince,Zunyi563003,China

Objective:To investigate the role of miR-581 overexpression on the proliferation of human colorectal cancer cell line SW620.Methods: The expression group,colorectal cancer SW620 cells were transfected with recombinant lentivirus vector (LV-miR-581) and miR-581 mimics(miR-581),the negative control group were transfected with negative control lentiviral vector (LV-GFP) and negative control mimics (vector).The mRNA expression of miR-581 was identified by qRT-PCR.Proliferation of the cells were detected by CCK8 assary and colony forming assary.Results: The expression of miR-581 at mRNA significantly increased in LV-miR-581 group compared with control groups were detected by qRT-PCR (P<0.05).Up-regulation of miR-581 markedly enhanced human colorectal cancer SW620 cells proliferation than those in the cells transfected with control vector (P<0.05).Conclusion: Forced expression of miR-581 accelerates the proliferation of colorectal cancer SW620 cells.

miR-581;Colorectal cancer;Proliferation

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.018

①本文受国家自然科学基金项目(81560407)资助。

李龙梅(1987年-)，女，在读硕士，主要从事临床免疫的研究。

及指导教师：冯继红(1977年-)，男，博士，副教授，主要从事结直肠癌侵袭转移及肿瘤干细胞调控机制研究，E-mail：jh_f@163.com。

R735.3

A

1000-484X(2017)02-0252-04

②遵义医学院附属医院肿瘤医院腹部肿瘤科，遵义563003。