混合皮肤移植中自体角朊细胞表达B7-H1诱导免疫抑制的相关研究①

蔡伟栋 柏 莹 祝先进 郑培烝 曹颖平 周光炎

(福建医科大学附属协和医院检验科,福州350001)

混合皮肤移植中自体角朊细胞表达B7-H1诱导免疫抑制的相关研究①

蔡伟栋 柏 莹 祝先进 郑培烝 曹颖平 周光炎②

(福建医科大学附属协和医院检验科,福州350001)

目的：探讨自体角朊细胞表达的B7-H1分子在混合皮肤移植中的作用和相关机制。方法：体外模拟混合皮肤移植模拟系统(MELC体系)，通过流式细胞术检测角朊细胞B7-H1和淋巴细胞PD-1的表达。同时，实时荧光定量PCR检测淋巴细胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表达。结果：流式细胞仪检测结果显示，在有自体角朊细胞参与的MELC体系中，随着作用时间增加，角朊细胞上B7-H1的表达和淋巴细胞上PD-1的表达水平均明显升高，且具有时间依赖性(P<0.01)；实时荧光定量PCR检测结果显示，随着作用时间增加，与无自体角朊细胞参与的MELC体系相比，在自体角朊细胞参与的MELC体系中，淋巴细胞IL-10、GATA-3、Foxp3 mRNA的表达水平均明显升高，且具有时间依赖性(P<0.01)。结论：在体外混合皮肤移植模拟系统中，自体角朊细胞通过表达共刺激分子B7-H1，上调淋巴细胞表面PD-1的表达，二者相结合，诱导Th2细胞和Foxp3+的Treg细胞分化，从而负向调节免疫反应。

角朊细胞； B7-H1；混合皮肤移植；免疫抑制

在上世纪七十年代初，我国外科医生创新性地运用自体皮与异体皮镶嵌的混合皮肤移植技术，抑制了免疫排斥反应，大幅度提高了烧伤治愈率[1,2]，但其免疫机制目前尚未明确。大量研究证实，构成皮肤主要细胞的角朊细胞在皮肤移植排斥反应中扮演重要的角色[1]。角朊细胞属于兼职抗原提呈细胞(APC)，与通常意义上的APC不同，其并不表达B7-1/B7-2，而是表达B7-H1。B7-H1是新近发现的一个B7分子，其受体不是CD28和CTLA-4而是PD-1，B7-H1与PD-1结合具有下调免疫应答的活性[3,4]。有学者研究发现，自体角朊细胞的免疫抑制作用确实与B7-H1 及其受体PD-1 有关，但其具体机制还有待进一步的研究。因此，在本实验中我们首先建立体外模拟混合皮肤移植模拟系统(MELC体系)，然后通过流式细胞术检测在有无自体角朊细胞的MELC体系中角朊细胞B7-H1和淋巴细胞PD-1的表达，用实时荧光定量PCR检测有无自体角朊细胞的MELC体系中淋巴细胞IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的表达，从而探讨B7-H1分子在自体角朊细胞诱导的混合皮肤移植免疫抑制中的作用和相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 取新生KM乳鼠按照文献[5]的方法分离皮块中的角朊细胞和表皮细胞；分离脾脏中的淋巴细胞。

1.1.2 试剂与仪器 小鼠B7-H1、PD-1流式检测抗体(Biolegend公司)，离心柱型总RNA提取试剂盒(Qiangen公司),逆转录试剂盒(Promaga公司)，实时荧光定量检测试剂盒(TaKaRa公司),FACScan 流式细胞仪(美国BD公司)，Lightcycle480荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和实验分组 将角朊细胞接种于完全K-SFM培养基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培养。表皮细胞和淋巴细胞分别接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基和RPMI1640培养基中，置37℃ 5%CO2孵育箱中培养，以备用。实验时调整角朊细胞的细胞浓度至1×106ml-1，表皮细胞至2×106ml-1，淋巴细胞至1×106ml-1，按如下比例进行混合培养(表1所示)，建立实验组和对照组。

1.2.2 流式细胞仪检测淋巴细胞表面PD-1和角朊细胞表面B7-H1的表达 收集各组待测细胞,用PBS洗涤2次，1 500 r/min离心10 min，弃上清液，用PBS 控制细胞悬液总体积为100 μl。向待测组中加入20 μl PE Anti-mouse PD-1或PE Anti-mouseCD274(B7-H1)，加入同体积同型对照抗体作为阴性对照管，混匀后置于4℃孵育30 min，用PBS洗2遍，再加入500 μl PBS 重悬细胞。上流式细胞仪分别对悬浮细胞的PD-1和贴壁细胞的B7-H1进行检测。

1.2.3 RT-PCR检测IL-10、Foxp3、GATA-3 mRNA的

表达 收集混合培养后12、24、36 h不同时间段的悬浮淋巴细胞，用离心柱法提取总RNA，逆转录合成cDNA,用于定量PCR检测目的基因的表达，并以β-actin作为内参对照。各基因引物序列由Primer express 2.0软件设计，委托TaKaRa公司合成(引物序列详见表2)。定量PCR体系总体积为20 μl，包括SYBE GREEN荧光Mix 10 μl,cDNA 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，ddH2O 7 μl。每组设3个复孔，在Lightcycle480荧光定量PCR仪上扩增：95℃ 2 min；95℃ 15 s，55℃ 15 s，68℃ 30 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算IL-10、Foxp3、GATA-3的相对表达量。

2 结果

2.1 在MELC体系中，有自体角朊细胞参与的实验组MELC中，角朊细胞B7-H1表达增高 在MELC体系中混合培养12、24、36 h后，通过流式细胞技术检测角朊细胞B7-H1表达，结果如表3、图1所示：在有自体角朊细胞参与的实验组中，角朊细胞B7-H1的表达呈递增趋势，且具有时间依赖性(F=220，P<0.01)；而在无自体角朊细胞参与的MELC体系中(对照组1和对照组2)角朊细胞B7-H1的表达无增高趋势(F值分别为1.25和3.55，P>0.05)。

2.2 在MELC体系中，有自体角朊细胞参与的实验组MELC中，淋巴细胞PD-1表达增高 在MELC体系中混合培养12、24、36 h后，通过流式细胞技术检测淋巴细胞PD-1的表达，结果如表4、图2所示：在有自体角朊细胞参与的实验组MELC 体系中，淋巴细胞PD-1的表达呈递增趋势，且具有时间依赖性(F=464，P<0.01)；而无自体角朊细胞参与的MELC体系中(对照组1、对照组2和对照组3)淋巴细胞PD-1的表达无明显增高(F值分别为0.898、2.540、0.695,P>0.05)。

表1 混合皮肤移植细胞模型

Tab.1 Intermingled skin grafting model(MELC)

ItemExperiencegroupControlgroup123ComponentLa∶Eb∶KaLa∶Eb∶KbLa∶KaLaProportion1∶1∶051∶1∶051∶051

Note：La.auto-lymphocytes;Ka.auto-keratinocytes;Kb.allo-keratino-cytes;Eb.allo-epidermal cell.

表2 实时定量PCR引物序列

Tab.2 Real-time quantitative PCR primer sequence

NameForwardprimerReverseprimerβ⁃actin5′⁃CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC⁃3′5′⁃ATGGAGCCACCGATCCACA⁃3′IL⁃105′⁃ACCTGCTCCACTGCCTTGCT⁃3′5′⁃GGTTGCCAAGCCTTATCGGA⁃3′Foxp35′⁃ACAACCTGAGCCTGCACAAGT⁃3′5′⁃GCCCACCTTTTCTTGGTTTTG⁃3′GATA⁃35′⁃ACCGGGTTCGGATGTAAGTC⁃3′5′⁃GTTCACACACTCCCTGCCTTCT⁃3′

2.3 在MELC体系中，有自体角朊细胞参与的实验组MELC中，淋巴细胞IL-10及GATA-3mRNA表达增高 如表5所示，在MELC 体系中混合培养12、24、36 h后，有自体角朊细胞参与的MELC体系与无自体角朊细胞参与的MELC体系相比，IL-10及GATA-3 mRNA的相对表达水平均明显升高，且具有时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4 在MELC体系中，有自体角朊细胞参与MELC体系中淋巴细胞Foxp3 mRNA表达增高 如表6所示，混合培养12、24、36 h后，有自体角朊细胞参与的MELC体系与无自体角朊细胞参与的MELC体系相比，Foxp3 mRNA的相对表达水平明显升高，且具有时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.01)。

表3 MELC体系中B7-H1的表达水平

Tab.3 Expressions of B7-H1 in MELC

TimeExperiencegroup(La+Eb+Ka)Controlgroup1(La+Eb+Kb)Controlgroup2(La+Ka)12h(2500±153)%(309±123)%(210±075)%24h(3950±182)%(439±161)%(473±166)%36h(5600±217)%(494±155)%(463±152)%F/Pvalue220/0001)

Note：1)Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

图1 MELC体系中B7-H1表达水平的动态变化Fig.1 Dynamic changes of proportion of B7-H1 in MELC

图2 MELC体系中PD-1表达水平的动态变化Fig.2 Dynamic changes of proportion of PD-1 in MELC

表4 MELC体系中PD-1的表达水平

Tab.4 Expressions of PD-1 in MELC

TimeExperiencegroupLa+Eb+KaControlgroup1La+Eb+KbControlgroup2La+KaControlgroup3La12h(515±106)%(225±104)%(328±093)%(389±127)%24h(2700±203)%(343±126)%(474±085)%(424±133)%36h(4770±188)%(248±112)%(317±102)%(314±084)%F/Pvalue464/0001)

Note：1) Compare among 12，24，36 h experience group,F=220,P<0.01.

TimeIL⁃10ABCGATA⁃3ABC12h087±007090±003085±035627±017655±003733±00224h1250±1441620±0042490±046718±013991±009794±00436h6020±0047560±0416050±0071050±0021060±003870±008F/Pvalue4269/0001)82160/0001)23932/0001)9657/0001)4239/0001)5048/0001)

Note：A.Expreience group compared with control group1;B.Experience group comared with control group 2;C.Experience groupcompared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

TimeABC12h1390±0062280±0773260±07724h1840±0513530±0208820±02336h11000±0319610±1908990±010F/Pvalue74099/0001)3264/0001)14618/0001)

Note：A.Experience group compared with control group 1;B.Experience group compared with control group 2;C.Experience group compared with control group 3.1)Compared among 12,24,36 h group,P<0.01.Experience group.La+Eb+Ka;Control group 1.La+Eb+Kb;Control group 2.La+Ka;Control group 3.La.

3 讨论

我国外科医生创造的混合皮肤移植(即在给受者移植入异体皮的同时嵌入受者的自体皮片)可以大大降低移植排斥反应。本课题组前期研究发现，在MELC体系中，自体角朊细胞可以诱导性表达B7-H1，且自体角朊细胞对混合皮肤移植排斥反应的抑制功能可以被抗B7-H1单抗完全遏止[5]。这一结果提示，B7-H1分子参与了自体角朊细胞对混合皮肤移植排斥反应的抑制过程。在本实验中，发现有自体角朊细胞参与的混合培养体系中，自体角朊细胞B7-H1呈高表达趋势，而未有自体角朊细胞参与的各对照组，角朊细胞B7-H1极低表达。这些实验结果进一步显示混合皮肤移植的免疫抑制作用与自体角朊细胞表达B7-H1分子有关。至于引起自体角朊细胞B7-H1表达升高的原因，目前尚不清楚。Ritprajak等[6]研究发现体外用IFN-γ刺激角朊细胞，其B7-H1表达上升，并抑制了浸润皮肤处T细胞的增殖反应。而在我们前期的研究中也证实IFN-γ确实可以刺激细胞表达B7-H1[7,8]。因而自体角朊细胞B7-H1表达升高可能与炎症因子的刺激有关：在生理状态下，角朊细胞不表达B7-H1，当皮肤组织受到外来刺激，局部分泌炎症因子IFN-γ，诱导其角朊细胞B7-H1的表达，从而反馈调节局部组织炎症反应强度。

那么，B7-H1分子是如何参与自体角朊细胞抑制混合皮肤移植排斥反应的？

现阶段研究认为B7-H1分子的受体并不与B7-1/B7-2相同，即不能通过与CTLA-4的相互作用而产生免疫抑制。PD-1是B7-H1的主要受体，有研究发现，PD-1与诱导移植耐受有关[9]。那么，混合皮肤移植是否也是通过PD-1分子的作用大大降低移植排斥反应呢？因而在本实验中用流式细胞术检测淋巴细胞PD-1的表达，结果显示在未有自体角朊细胞参与的MELC体系中，淋巴细胞PD-1呈极低表达状态，而在有自体角朊细胞参与的MELC体系中，淋巴细胞PD-1的表达明显增高，且随着作用时间的延长呈递增趋势。有国外学者研究发现，B7-H1与PD-1的结合，可抑制T细胞的活化，维持外周免疫耐受[3]。故在混合皮肤移植体系中，某种作用因素增加淋巴细胞表面PD-1的表达，上调B7-H1与PD-1的结合率，从而介导免疫抑制，最终对混合皮肤移植排斥反应产生抑制。

另外，本课题组前期研究发现，自体角朊细胞可行使非专业性抗原递呈细胞的功能，由B7-H1提供共刺激信号，促进IL-10分泌的Th2型细胞分化，进而抑制Th1型细胞，诱导Th1型细胞向Th2型细胞极化[10,11]。GATA-3为Th2型细胞的标志性转录因子[12]。我们采用实时荧光定量PCR监测GATA-3和IL-10mRNA的表达，发现在MELC体系中淋巴细胞GATA-3和IL-10mRNA均呈明显的高表达趋势，从另一角度验证了先前的观点：角朊细胞可能通过表达B7-H1诱导Th1型细胞向Th2型细胞极化，分泌Th2型细胞因子，最终对免疫反应产生抑制。

Treg细胞是一类具有负调节作用的T细胞亚群，其中Foxp3是其特异性调节因子[13,14]。近年研究发现，角朊细胞可诱导产生Treg细胞，负向调节免疫反应。那么，在MELC体系中角朊细胞是否能够诱导产生Treg细胞，从而介导免疫抑制呢？本实验采用实时荧光定量PCR动态检测MELC体系中淋巴细胞Foxp3基因的表达。我们发现在有自体角朊细胞参与的MELC体系与无自体角朊细胞参与的MELC体系相比，Foxp3呈高表达趋势。鉴于有报道认为B7-H1能够促进Treg细胞的分化，并能维持Foxp3的表达及成熟Treg细胞的抑制功能[15,16]，故我们推测在MELC体系中淋巴细胞Foxp3基因表达增高的原因可能与自体角朊细胞表达B7-H1有关，这可能也是混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导局部免疫耐受的机制之一。但这种Treg细胞与之前MELC体系中检测出的可分泌IL-10的淋巴细胞是否为同一群细胞，本实验由于细胞分离技术的限制并未探讨，尚需更深入的研究。

本研究通过建立体外混合皮肤移植模拟系统(MELC体系)，研究发现，自体角朊细胞通过表达共刺激分子B7-H1，上调淋巴细胞表面PD-1的表达，二者相结合，诱导Th2细胞和Foxp3+的Treg细胞分化，从而负向调节免疫反应。这些研究阐明了混合皮肤移植中角朊细胞诱导局部耐受的机制，为烧伤移植的治疗提供了新的实验室监测指标和思路。

[1] 史济湘.自异体皮混合移植的临床意义与排异机制[J].中华烧伤杂志,2006,22(1):76-78.

[2] Domres B,Kistler D,Rutczynska J.Intermingled skin grafting:a valid transplantion method at low cost[J].Annals Burns Fire Disa Sters,2007,20(3):149-154.

[3] Yao S,Zhu Y,Chen L.Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation[J].Nat Rev Drug Discov,2013,12(2):130-146.

[4] Sui X,Ma J,Han W,etal.The anticancer immune response of anti-PD-1/PD-L1 and the genetic determinants of response to anti-PD-1/PD-L1 antibodies in cancer patients[J].Oncotarget,2015,6(23):19393-19404.

[5] 张敬喜,曹颖平,王梅华,等.B7-H1分子在混合皮肤移植中自体角朊细胞诱导的抑制作用[J].福建医科大学学报,2006,40(2):105-107.

[6] Ritprajak P,hashiguchi M,Tsushima F.Keratinocyte-associated B7-H1 directly regulats cutaneous effector CD8+T cell responses[J].J Immunol,2010,184(9):4918-4925.

[7] Kryczek I, Wei S, Gong W.Cutting edge:IFN-{gamma} enables APC to promote memory Th17 and abate Th1 cell development[J].Immunology,2008,181:5842-5846.

[8] Yamamoto R,Nishikori M,Tashima M.B7-H1 expression is regulated by MEK/ERK signaling pathway in anaplastic large cell lymphoma and Hodgkin lymphoma[J].Cancer Sci,2009,100(11):2093-2100.

[9] 郭国宁,谢谆怡,陈永文.共抑制分子PD-1的研究进展[J].免疫学杂志, 2010, 26(7):639-642.

[10] 曹颖平,陈卫闽,罗心绮,等.混合皮肤移植中IL-10在自体角朊细胞诱导局部免疫耐受中的作用[J].中国免疫学杂志,2005,21(3):184-189.

[11] Cao Y,Zhou H,Tao J.Keratinocytes induce local tolerance to skingraft by activating IL-10-secreting T cells in the context of costimulation molecule B7-H1 [J].Transplantation,2003,75(8):1390.

[12] Yagi R,Zhu J,Paul W.An updated view on transcription factor GATA3-mediated regulation of Th1 and Th2 cell differentiation[J].Int Immunol,2011,23(7):415-420.

[13] Ohkuran N,Kitagawa Y,Sakaguchi S.Development and maintenance of regulatory T cells[J].Immunity,2013,38(3):414-423.

[14] Lan Q,Fan H,Quesniaux V.Induced Foxp3(+) regulatory T cells:a potential new weapon to treat autoimmune and inflammatory diseases?[J].Mol Cell Biol,2012,4(1):22-28.

[15] Francisco LM,Salinas VH,Brown KE,etal.PD-L1 regulates the development,maintenance,and function of induced regulatory T cells[J].J Exp Med,2009,206(13):3015-3029.

[16] Hua D,Sun J,Mao Y,etal.B7-H1 expression is associated with expansion of regulatory T cells in colorectal carcinoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(9):971-978.

[收稿2016-04-06 修回2016-06-24]

(编辑 许四平)

Related research of immunosuppression in intermingled skin transplantation induced by B7-H1 expressed on auto-keratinocytes

CAIWei-Dong,BAIYing,ZHUXian-Jin,ZHENGPei-Zheng,CAOYing-Ping,ZHOUGuang-Yan.

DepartmentofClinicalLaboratory，FujianMedicalUniversityUnionHospital，Fuzhou350001,China

Objective:To explore the role and mechanism of the B7-H1 expressed by auto-keratinocytes in the intermingled skin grafting model in vitro(MELC).Methods: The intermingled skin grafting model(MELC) was established in vitro.Flow cytometry was performed to detect the expressions of B7-H1 in keratinocytes.The expressions of PD-1 in lymphocytes were measured at the same time.The levels of IL-10,Foxp3 and GATA-3 mRNA in lymphocytes were detected by Real-time quantitative PCR.Results: Through flow eytometry,in the MELC with auto-keratinocytes,the expression of B7-H1 in auto-keratinocytes and the PD-1 in lymphocytes were rising trend and the rising rate was in time-dependent manners(P<0.01).RT-PCR assay indicated that the relative levels of IL-10,Foxp3,GATA-3mRNA expression were significant raised and the rising rate was in time-dependent manners (P<0.01).Conclusion: In the intermingled skin grafting model,the auto-keratinocytes could express B7-H1 to enhance the expression of PD-1 in T cells.When B7-H1 combined with PD-1,the Th2 cells and Foxp3+Tregs were induced and suppressed the immune response in the intermingled skin grafting model.

Keratinocytes;B7-H1;Intermingled skin transplantation；Immunosuppression

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.003

①本文为国家自然科学基金项目(81171656)。

蔡伟栋(1990 年-)，男，在读硕士，主要从事免疫调节和移植免疫的研究。

及指导教师：曹颖平(1970 年-)，男，博士，主任检验师，教授，硕士生导师，主要从事免疫调节和移植免疫的研究，E-mail:caoyingping@ailyun.com。

R392.4

A

1000-484X(2017)02-0174-05

②上海市免疫学研究所，上海200025。