富血小板血浆对脂肪干细胞体外增殖及成脂分化的影响

李锋，黄盛斌，赵树蕃，邓辉

（1.温州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，浙江温州 325027；2.温州医科大学附属口腔医院口腔医学研究所，浙江温州 325027；3.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东广州 510120；4.温州医科大学附属口腔医院牙周科，浙江温州 325027）

·论 著·

富血小板血浆对脂肪干细胞体外增殖及成脂分化的影响

李锋1，黄盛斌2，赵树蕃3，邓辉4

（1.温州医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，浙江温州 325027；2.温州医科大学附属口腔医院口腔医学研究所，浙江温州 325027；3.广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心口腔科，广东广州 510120；4.温州医科大学附属口腔医院牙周科，浙江温州 325027）

目的：研究不同体积分数富血小板血浆（PRP）对脂肪干细胞（ASCs）体外增殖及成脂分化的影响。方法：采用酶消化组织块法分离培养ASCs，有限稀释法克隆纯化，检测细胞表面标志物并进行鉴定。改良两步离心法从人全血中制备PRP。利用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测在培养基中分别添加不同体积分数（0、10%、20%、30%）PRP对ASCs增殖的影响。反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测在成脂诱导培养基中添加不同体积分数PRP对ASCs成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪分化相关蛋白（adipophilin）表达的影响。结果：CCK-8结果显示，培养基中添加PRP显著促进了ASCs的增殖（P＜0.01）；与10% PRP相比，20% PRP或30% PRP更好地促进了ASCs的增殖（P＜0.01），而20% PRP与30% PRP相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。RT-PCR结果显示，成脂诱导培养基中添加PRP时，PPARγ、LPL、adipophilin表达均明显升高（P＜0.05），而加入PRP的体积分数为10%、20%、30%时，对PPARγ、adipophilin表达的影响差异无统计学意义（P＞0.05），以20% PRP对LPL表达的促进作用最为明显（P＜0.01）。结论：PRP可以促进ASCs体外增殖及成脂分化，对脂肪组织再生有重要研究价值。

富血小板血浆；脂肪干细胞；细胞增殖；成脂分化

各种原因导致的软组织缺损不仅损毁患者外部容貌，还严重影响其心理、社会功能等，一直是创伤整形和修复重建外科所面临的难题[1]。目前临床软组织修复重建的常用方法包括人工合成替代物植入、自体组织瓣移植、自体脂肪移植[2]。各种人工合成材料植入人体后容易破裂泄漏、移位、产生异物排斥反应、不能进行功能改建[3]，而液态硅胶注射更是被许多国家明令禁止；自体组织瓣移植实际属于“拆东墙补西墙”，塑形难、组织量难以保证，且会造成供区损伤及继发畸形；自体脂肪移植的存活率较低，一般为30%～60%[4]，这极大地影响了自体脂肪移植的远期疗效。近年来，组织工程技术迅猛发展，为软组织缺损的重建带来了新的希望。脂肪组织工程包括种子细胞、支架材料及生长因子3个要素[3]。

2001年，ZUK等[5]首次发表关于脂肪组织中存在多能干细胞的研究后，脂肪干细胞（adiposederivedstemcells，ASCs）成为研究热门。ASCs可以从脂肪组织中大量获取，具有组织来源丰富、取材方便、获取过程微创等优点，且ASCs具有更稳定的增殖活性、自我更新能力和更强的成脂、成骨、成内皮细胞等多向分化潜能[6]，因此，ASCs是脂肪组织工程中促进脂肪再生的理想种子细胞。

富血小板血浆（platelet-richplasma，PRP）是自体全血经过多次差速离心得到的含有高浓度血小板的血浆[7]，其被激活后可释放出高浓度的血小板衍化生长因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、成纤维细胞生长因子（fibroblasticgrowthfactor，FGF）、血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）、表皮生长因子（epidermalgrowthfactor，EGF）等[8]，这些细胞生长因子对细胞的形态发生、增殖、分化、新生血管形成等起到诱导促进作用；激活后的PRP还含有纤维蛋白、纤维黏连蛋白、玻璃黏连蛋白等蛋白质[9]，形成精细的纤维蛋白网状结构，具有促进细胞黏附、防止细胞流失功能。本研究旨在探讨PRP对ASCs体外增殖及成脂分化的影响，观察将PRP及ASCs应用于脂肪组织工程的可行性。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器I型胶原酶（collagenasetype I；Hyclone，美国）、α-MEM培养基（alphamodifiedminimumessentialmedium，α-MEM；Hyclone，美国）、胎牛血清（fetalbovineserum，FBS；Hyclone，美国）、双抗（青霉素、链霉素；Millipore，USA）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美国）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA；AidScience，上海）；细胞计数试剂盒（cellcountingkit-8，CCK-8；Dojindo，日本）、RNAisoPlusTotalRNA提取试剂（TaKaRa，日本）、PrimeScript®RTreagentkit反转录试剂盒（TaKaRa，日本）、SYBR®PremixExTaqTMPerfectRealTime（TaKaRa，日本）；血细胞分析仪（SysmexXS-800i；Sysmex，日本）、ThermoKS12超净工作台（Thermo，美国）、恒温水浴箱（Heto-Hoten，丹麦）、倒置相差显微镜（LeicaDMI6000，德国）、酶标仪（Thermo，美国）、低速离心机（湘仪，湘潭）、温控台式离心机SORVALLRLEGENDT（Thermo，美国）、微量移液器（Thermo，美国）。

1.2 ASCs的分离培养和鉴定①ASCs分离培养：脂肪抽吸术中获取约15mL人腹部皮下脂肪组织；于超净工作台内用加有双抗的无菌磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline，PBS）反复漂洗脂肪组织，用眼科剪充分剪碎并去除肉眼可见的血管及筋膜组织；加入等体积0.15%I型胶原酶混匀于37℃恒温摇床消化30min；在200×g下离心10min，去除上层油脂、脂肪组织等，将离心管底部的细胞团用含10%FBS、1%双抗的α-MEM培养基重悬，接种于细胞培养瓶中，置于饱和湿度、37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养；原代培养96h后予以更换培养基，去除未贴壁细胞；倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，待细胞在培养瓶底达90%融合时，用0.25%胰蛋白酶予以消化并接种至新的培养基中进行传代培养。②ASCs表面分子标志检测：取生长状态良好的第3代ASCs，待其达到90%融合时，0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗后于低速离心机1000r/min离心5min，用PBS重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1.0×106/mL；将所制备单细胞悬液分装入10支1.5mLEP管，每支1.0mL，1000r/min离心5min，用100μLPBS重悬细胞；在上述10支EP管中，随机选1支不加抗体作为空白对照，其余9支分别加入20μLCD14-FITC、20μLCD29-PE、20μLCD31-FITC、20μLCD34-FITC、20μLCD44-FITC、20μLCD45-FITC、20μLCD49d-PE、5μLCD105-PE、20μLCD106-PE于4℃避光孵育30min；孵育完毕后，向各EP管中加入1mLPBS重悬细胞，1000r/min离心5min，弃去上清；用300μLPBS重悬细胞，经过200目细胞筛过滤转移至流式离心管中，将各流式离心管放入流式细胞仪检测。

1.3 PRP的制备及血小板计数将健康志愿者捐献的400mL全血平均分装在20支离心管中，从每支离心管中吸取0.5mL全血，利用血细胞分析仪自动计数其中的血小板数量。将20支离心管130×g离心15min，可见其中的血液大致分为上下2层：上层为血浆，下层为红细胞；从每支离心管中分别吸出3mL血浆备用。将20支离心管中剩余的血液分别用等体积的PBS进行稀释后缓慢加入含有淋巴细胞分离液的另外20支离心管，使血液与淋巴细胞分离液之间界限清晰；将以上20支离心管250×g离心15min，可见其中的液体从上到下分为界限清晰的4层：血浆层、富含血小板及白细胞的棕黄层、淋巴细胞分离液层、红细胞层；使用微量移液器小心吸取20支离心管中的棕黄层，用PBS离心清洗（200×g、4℃、10min）2次后分别用之前提取的3mL血浆重悬，吹打混匀即得PRP；利用血细胞分析仪对以上20份3mL的PRP样本分别进行血小板计数。将所得20份PRP样本混合均匀，备用。

PRP的激活：取上述PRP，分装在20支离心管中，每支离心管中加入0.5mL人凝血酶溶液（由500U凝血酶冻干粉溶解在0.5mL1%CaCl2溶液制得，现制现用），可见PRP即被激活成凝胶状；将离心管置于4℃过夜，以使其中的成分充分反应，第2日晨即可见有上清液渗出。将各离心管3000×g离心10min，收集上清液进行后续实验。

1.4 不同体积分数PRP对ASCs增殖的影响采用CCK-8检测PRP对ASCs体外增殖的影响。待第2代ASCs生长达到约90%融合时，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，按以下5个分组制备ASCs细胞悬液：①阴性对照组：3.0mLα-MEM+1.5×105ASCs；②阳性对照组：3.0mLα-MEM+10%FBS+1.5×105ASCs；③10%PRP组：3.0mLα-MEM+10%PRP+1.5×105ASCs；④20%PRP组：3.0mLα-MEM+20%PRP+1.5×105ASCs；⑤30%PRP组：3.0mLα-MEM+30%PRP+1.5×105ASCs。将上述各组ASCs细胞悬液接种在96孔培养板中，每组均接种28孔，每孔均含细胞悬液100μL，在培养第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7天后，每组各取培养板内4孔，分别加入10μLCCK-8溶液（注意轻手操作，不要在孔内生成气泡），置于细胞培养箱中继续避光孵育3h，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值（opticaldensity，OD）。以培养时间为横坐标，OD值的±s为纵坐标，绘制ASCs的生长曲线。

1.5 不同体积分数PRP对ASCs成脂分化的影响取贴壁生长达90%左右融合的第3代ASCs，在以下5种环境下进行培养：①阴性对照组：α-MEM+10%FBS；②阳性对照组：成脂诱导培养基（α-MEM培养基中加入10%FBS，1μmol/L地塞米松，5mg/L胰岛素，0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛）；③10%PRP组：成脂诱导培养基+10%PRP；④20%PRP组：成脂诱导培养基+20%PRP；⑤30%PRP组：成脂诱导培养基+30%PRP。各组ASCs诱导培养3周后，提取各组细胞总RNA，利用KaTaRaPrimeScript®RTreagentKit试剂盒反转录合成cDNA，通过ABIPRISMR®7300RealTimePCR仪扩增，检测各组细胞中成脂分化相关基因过氧化物酶体增殖体激活受体γ（peroxisomeproliferators-activatedreceptorsγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、脂肪分化相关蛋白（adipophilin）以及内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）的表达情况。引物设计见表1。质量控制及数据分析：实验重复3次，每次实验设置3组复孔，所有操作均在相同条件下由同一人完成，尽量减少实验的误差。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 统计学处理方法利用7300SystemSDS软件对数据进行解析，按照2-△△Ct=2-[（Ct目的基因- Ct内参基因）诱导后细胞-（Ct目的基因-Ct内参基因）阴性对照细胞]对基因的相对表达进行分析。采用SPSS17.0统计学软件进行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ASCs的分离与培养原代培养72h左右可见贴壁细胞逐渐增多，见图1A。原代培养9d左右细胞达到80%～90%融合，此时应及时进行传代培养。传代后的细胞生长较迅速，一般3～4d即可达90%融合；且经过1～2代的传代培养后，得到较为纯化的ASCs，为成纤维细胞样长梭形，形态均一，见图1B。

图1 ASCs的培养图（×100）

2.2 ASCs表面分子标志的检测流式细胞术检测第3代ASCs表面分子标志表明，ASCs阳性表达CD29（为95.8%）、CD44（为95.9%）、CD49d（为50.6%）、CD105（为95.2%），而阴性表达CD14（为1.4%）、CD31（为2.0%）、CD34（为1.8%）、CD45（为4.2%）、CD106（为5.5%），见图2。

2.3 全血及PRP中的血小板检测本研究对获取的20份PRP样本进行血小板计数，并与全血中的血小板计数比较，见表2。全血中的血小板计数为（171.0±32.3）×109/L，PRP中的血小板计数为（1531.3±297.9）×109/L；符合PRP中的血小板浓度应达到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

2.4 PRP对ASCs增殖的影响CCK-8所得各组ASCs生长曲线见图3，第4天时各组细胞的OD值统计学比较见图4。CCK-8结果示：与阴性对照组相比，培养基中添加FBS或PRP均明显促进了ASCs的增殖（P＜0.01）；各浓度组PRP对ASCs增殖的促进作用明显优于FBS（P＜0.01）；与10%PRP组相比，20%PRP组或30%PRP组更好地促进了ASCs的增殖（P＜0.01），而20%PRP组与30%PRP组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 PRP对ASCs成脂分化的影响ASCs在不同的条件下诱导培养3周后，RT-PCR结果见图5。与阴性对照组相比，阳性对照组的成脂诱导培养基明显促进了ASCs的成脂分化，成脂相关基因PPARγ、LPL、adipophilin表达均明显升高（P＜0.01）；成脂诱导培养基中添加PRP时，PPARγ、LPL、adipophilin表达均明显升高（P＜0.05），而加入PRP的体积分数为10%、20%、30%时，对PPARγ、adipophilin表达的影响差异有统计学意义（P＜0.05），20%PRP组对LPL表达的促进作用最为明显（P＜0.01）。

3 讨论

本研究首先利用胶原酶消化法，从人离体脂肪组织中分离培养ASCs，并对细胞分子表面标志加以检测。经过传代纯化后，ASCs呈梭形贴壁生长，且具有较强的增殖能力。间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSCs）通过分子表面抗原黏附于细胞外基质[10]，ASCs阳性表达黏附分子CD29及CD44，使其黏附于细胞外基质；同时ASCs还阳性表达CD105，与CD29、CD44一起体现了ASCs具有MSCs的表面分子特性[11]；阴性表达CD14、CD31、CD34及CD45说明该实验所得的ASCs不是造血/白细胞/内皮细胞[12]；此外，ASCs阳性表达CD49d，而阴性表达CD106，这与骨髓间充质干细胞（bonemarrowderivedstemcells，BMSCs）正好相反[13]，结合细胞组织来源，从而说明了本研究所获取的细胞并非BMSCs。

本研究采用BAUSSET等[14]建议的两步离心法来制备PRP；另外，在此基础上选用沉降系数在红细胞与血小板之间的人淋巴细胞分离液，使离心过程中红细胞与棕黄层完全分隔开来，去除了红细胞的掺杂，进一步提升了血小板回收率，本研究得到的PRP中血小板浓度为全血中的8.95倍，远远满足PRP中的血小板浓度应达到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

图2 第3代ASCs表面分子标志的流式细胞术检测结果

表2 全血及PRP中血小板计数结果（×109/L）

CCK-8检测表明，培养基中加入PRP能够明显促进ASCs的增殖，这是因为PRP激活后能够释放高浓度的PDGF、TGF-β、FGF等生长因子，它们能够刺激、促进MSCs的有丝分裂，促进细胞内周期蛋白CyclinD1的表达，从而加速细胞增殖[15-16]。本研究进一步比较了不同量的PRP对ASCs增殖的影响，发现20%为最适宜的用量。尽管有少数关于PRP对ASCs增殖影响的研究，但对于PRP的最佳用量却结论不一。KAKUDO等[17]认为培养基中添加5%PRP能够明显促进ASCs的增殖，但是当增加到20%时基本无促进作用；而LIU等[18]却报道PRP促进ASCs增殖的最佳浓度为10%～12.5%。分析原因可能由不同的研究中PRP的制备方法、内含血小板或生长因子的浓度不同所致。

图3 不同培养条件下ASCs的增殖曲线

图4 各组ASCs第4天时OD值比较

图5 各组ASCs成脂分化相关基因表达比较

RT-PCR结果显示，ASCs经成脂诱导培养基诱导培养3周后，成脂分化相关基因PPARγ、LPL、adipophilin表达上调，而在诱导培养基中添加PRP使这些基因的表达进一步升高。既往研究表明：PPARγ在脂肪生成相关基因的调节中发挥关键作用[19]；LPL是脂肪生成过程中的一种脂质交换酶[20]；adipophilin与细胞和组织中的脂质堆积密切相关[21]。这些基因表达的上调说明PRP促进了ASCs的成脂分化。这或许是由PRP中所含的TGF引起，有研究表明TGF超家族成员之一的骨形成蛋白-2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）可以诱导间充质祖细胞向脂肪细胞分化[22-23]。另外，有研究[24]表明，PRP可与胰岛素协同作用一起促进ASCs的成脂分化。这些研究与我们的实验结果都说明了PRP能够促进ASCs向脂肪细胞分化。

综上所述，我们制备的PRP对ASCs的增殖及成脂分化均有一定促进作用，且以20%体积分数PRP作用为佳；本研究为PRP、ASCs应用于脂肪组织再生提供了前期理论基础。

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（本文编辑：吴昔昔）

Effects of platelet-rich plasma on proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells in vitro

LI Feng1, HUANG Shengbin2, ZHAO Shupan3, DENG Hui4. 1.Department of Oral and Maxillofacial

Surgery, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Institute of Oral Science, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 3.Department of Stomatology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou, 510120; 4.Department of Periodontics, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To evaluate the effects of platelet-rich plasma (PRP) on the proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in vitro.Methods:ASCs were isolated and cultured from human free fat tissue. The surface molecular markers of ASCs were determined with fow cytometry. PRP was prepared from human whole blood. Cell count kit-8 (CCK-8) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to evaluate the infuence of PRP (0, 10%, 20%, and 30%) in medium on ASC proliferation and adipogenic differentiation, respectively.Results:The platelet count in PRP was over 5 times of that in whole blood. CCK-8 showed that medium supplemented with PRP promoted ASCs proliferation signifcantly and the stimulatory potency of 20% PRP was the greatest. RT-PCR detected upregulated adipogenic-related genes, such as peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), lipoprotein lipase (LPL) and adipophilin.Conclusion:These results indicates PRP facilitated the proliferation and adipogenic differentiation of ASCs, which is of great value for adipose tissue engineering.

platelet-rich plasma; adipose-derived stem cells; cell proliferation; adipogenic differentiation

R78

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.002

2016-05-31

国家自然科学基金资助项目（81500817）；浙江省自然科学基金资助项目（LY15H140008）；温州市公益技术研究医学项目（Y20140708）；浙江省医药卫生科技计划一般项目（2016KYB184）。

李锋（1985-），男，山东泰安人，主治医师，博士。

邓辉，副教授，副主任医师，Email：dh0726@163.com。