绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

岑丹维，宋易玲，张婵琼，毛珊珊，叶晓鲜，陈俊，陈韶，朱珊丽，张丽芳

（温州医科大学分子病毒与免疫研究所，浙江温州 325035）

·论 著·

绿脓杆菌外毒素PE38KDEL重组蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

岑丹维，宋易玲，张婵琼，毛珊珊，叶晓鲜，陈俊，陈韶，朱珊丽，张丽芳

（温州医科大学分子病毒与免疫研究所，浙江温州 325035）

目的：通过原核表达系统制备绿脓杆菌外毒素（PE）PE38KDEL重组蛋白，并制备特异性兔免疫血清多克隆抗体。方法：选择PE部分基因（PE38），并将C端609-613位的氨基酸REDLK突变为KDEL，通过原核密码子优化（http://www.jcat.de）后全基因合成，经Hind I I I和Xho I酶切位点克隆至pET32a（+）原核表达载体，构建pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒，将测序正确的重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细菌中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组PE38KDEL蛋白，经Ni-NTA亲和层析法制备纯化蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。进一步将PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔制备PE38KDEL特异性多克隆抗体，并采集免疫前后血清，用ELISA法检测免疫后的抗体反应和效价。结果：成功构建了pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒。在原核表达系统中该质粒成功表达并获得纯化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE电泳显示蛋白分子质量约为57 kDa，与预计理论值大小相符合。Western blot法检测结果显示，在分子质量约57 kDa处出现单一条带。通过免疫大耳白兔成功获得PE38KDEL特异性多克隆抗体，抗体效价高达1:60 000。结论：PE38KDEL蛋白可诱导兔产生特异性多克隆血清抗体，且该抗体效价高、特异性强，为进一步研究基于PE38KDEL毒素的生物学和免疫学等功能奠定了基础。

铜绿假单胞菌；外毒素类；PE38KDEL；多克隆抗体；兔

绿脓杆菌在自然界分布广泛，常引起人类伤口的化脓性感染，由于感染后脓液和渗出液呈绿色，亦被称为铜绿色假单胞菌，其致病特点为致病力较低但抗药性强。绿脓杆菌分泌的绿脓杆菌外毒素（Pseudomonasaeruginosaexotoxin，PE）可通过抑制细胞蛋白质合成，发挥损伤和杀死细胞的作用[1]。由于这种特性，将PE与特定的载体结合（如单克隆抗体、细胞因子等）组成相应的免疫毒素，可用于肿瘤的靶向治疗研究[2]。相对于传统的化疗和放疗，免疫毒素治疗具有靶向性，能特异性杀伤肿瘤细胞，近年来，PE类重组免疫毒素被广泛报道[3]。将PE的C端REDLK突变为KDEL获得的PE38KDEL，进入细胞的跨膜能力和毒素作用活性变得更强，因此PE38KDEL更适合作为免疫毒素的毒素部分进行研究[4]。本研究通过对PE毒素密码子的原核优化及碱基突变，获得经修饰的PE38KDEL基因，并通过全基因合成及分子克隆技术，构建了原核表达重组质粒，经原核系统制备PE38KDEL重组蛋白，进一步免疫日本大耳白兔制备了PE38KDEL特异性兔多克隆抗体，为基于PE38KDEL免疫毒素的生物学和免疫学等功能研究提供了必要的检测抗体。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与酶类：蛋白电泳marker、限制性内切酶HindIII和XhoI、T4DNA连接酶均购自美国Fermentas公司，PCR产物纯化试剂盒、1kbDNAmarker、DL2000DNAmarker、2×TaqPCRMix、质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司，Cycle-pure纯化试剂盒、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂均购自美国Sigma公司，氨苄青霉素购自山东齐鲁制药有限公司，异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）购自德国默克公司，鼠抗His单克隆抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）抗体购自杭州联科生物技术有限公司，镍螯合亲和层析胶体（Ni-NTAAgarose）购自美国Qiagen公司，脱脂奶粉购自美国BD公司，单组分TMB显色液购自湖州英创生物科技有限公司。

1.1.2 质粒和菌株：pET32a（+）克隆载体和E.coliBL21（DE3）均为本实验室原先保存。

1.1.3 实验动物：健康日本大耳白兔，雄性，体质量1.8～2.4kg，由温州医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK（浙）2014-0006。

1.2 方法

1.2.1 PE38KDEL重组质粒构建：从GenBank中获取PE全长毒素（AE004091.2）的全氨基酸序列后缺失整个DomainIa区获得PE40氨基酸序列，在其基础上将第365-第380位的氨基酸缺失，并将羧基端REDLK通过突变修饰为KDEL，从而获得PE改造后的PE38KDEL氨基酸序列，通过生物网站进行原核表达密码子优化（http://www.jcat.de/）获得PE38KDEL密码子优化全基因序列，交由上海生物工程有限公司全基因合成后，克隆至pET32a（+）载体，构建pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒。将重组质粒转化到E.coliBL21（DE3）感受态细菌，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，并用特异性引物（OzlfFT：CCGCCGAAAGACGAACTGTAACTCGAG，OzlfRT：CCGCCGAAAGACGAACTGTAACTCGAG）进行PCR验证，提取阳性克隆菌株DNA后经酶切和测序鉴定。质粒的提取、酶切、酶连、转化等按照分子克隆技术常规方法进行。

1.2.2 PE38KDEL重组蛋白表达、鉴定及纯化：将pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒转化入E.coliBL21（DE3）后，接种至1mL含100μg/mL终浓度氨苄青霉素的LB培养液中，37℃，250r/min震荡培养过夜。培养至吸光度A600=0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃，250r/min诱导8h后12000r/min离心5min收集细菌菌体，加入40μL8mol/L尿素溶解菌体沉淀，经100℃加热煮沸5min破菌，取样进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。小鼠抗His单克隆抗体为一抗（1:10000），HRP-羊抗鼠IgG（H+L）作为二抗，进行Westernblot分析和鉴定。经SDS-PAGE电泳和Westernblot法鉴定后进行重组蛋白的纯化，即进一步收集经IPTG诱导后的菌液，经PBS洗涤2次后加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度为1mmol/L，冰浴中超声破菌，12000r/min离心20min收集上清，用Ni-NTAAgarose亲和层析柱纯化和收集纯化后的蛋白。

1.2.3 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体的制备及效价分析：PE38KDEL纯化蛋白免疫日本大耳白兔，分为3组，分别是PE38KDE10μg组、PE38KDE50μg组、PE38KDE100μg组，同时设置TRX-His蛋白对照组和PBS对照组。分别于1、3、5周时进行免疫，首次免疫抗原与完全弗氏佐剂等量混合，充分乳化，第2、第3次免疫抗原与不完全弗氏佐剂等量混合，每次每只家兔于背部皮下多点注射。同时，于0、2、4、6周时兔耳缘静脉取血，于第8周时心脏取血，收集的血液于37℃水浴锅中静置30min后，放置于高速离心机中，4℃，3000r/min离心10min，分离上层血清并置于-80℃分装保存备用。

用间接ELISA法检测0、2、4、6、8周时的血清抗体反应。即将PE38KDEL纯化蛋白按终浓度10μg/mL包被ELISA板，放置于4℃包被过夜，经PBS洗涤、3%脱脂牛奶封闭，将免疫的兔血清稀释为1:100，二抗为HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）。反应结果置于BioElx800酶标仪中，于450nm波长处读取吸光度（A）值，所有血清标本均重复3孔，以TRX-His蛋白和PBS免疫血清作为对照组。同时ELI-SA法检测免疫6周后血清抗体效价，方法同上，经洗涤、封闭后将6周时的血清分别倍比稀释为1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500，所有血清标本均重复3孔。

1.2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴定：诱导表达后的PE38KDEL菌株和纯化后的PE-38KDEL蛋白经电泳转膜，以1:10000稀释的兔多克隆血清抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔抗体IgG（H+L）为二抗，进行Westernblot检测，ECL发光液显色分析。

2 结果

2.1 pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒构建及鉴定

通过全基因合成PE38KDEL片段，通过HindI I I和XhoI酶切位点将其克隆至pET32a（+）载体相应位置，成功构建了pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒（见图1A）。琼脂糖凝胶电泳分析显示，在约7000bp位置可见清晰单一的重组质粒条带。通过特异性引物PCR扩增鉴定，在图1B中第3泳道可见约1100bp单一条带，证明了所构建重组质粒正确。进一步测序结果显示，重组质粒构建完全正确（见图1C）。

2.2 pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒原核表达及鉴定通过将重组质粒导入BL21大肠杆菌，经IPTG诱导表达，裂解菌体后取上清小样经SDS-PAGE电泳分析可见诱导后在57kDa位置出现蛋白条带，未诱导的重组菌体则无此条带。通过Ni-NTA亲和层析，在57kDa位置同样出现单一清晰的电泳条带并且与理论预计蛋白大小相符，表明重组质粒转化、诱导及纯化成功（见图2A）。通过Westernblot法（一抗为His鼠单克隆抗体）检测，在57kDa处出现阳性单一条带（见图2B）。

2.3 PE38KDEL蛋白免疫后兔血清抗体IgG反应及效价通过ELISA法检测抗体反应和效价，结果显示，在蛋白免疫家兔2周后，注射PE38KDEL重组蛋白的家兔开始出现特异性IgG抗体反应，至第6周时血清免疫效果达最高峰（见图3A）。PE38KDEL蛋白3个免疫剂量组之间的IgG抗体反应随蛋白注射剂量增大而加强（见图3B）。取6周时免疫血清做抗体稀释滴度检测，间接ELISA法检测结果显示，100μg免疫组PE38KDEL多克隆抗体血清的效价可达1:60000（见图3C）。

2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗体特异性分析鉴定

诱导表达后的PE38KDEL菌株和纯化后的PE38KDEL蛋白经电泳转膜，以免疫后第6周家兔血清抗体为一抗，HRP标记的山羊抗兔抗体IgG（H+L）为二抗，用Westernblot法检测其与PE38KDEL蛋白结合的特异性。结果显示，在相对分子质量约57kDa处可见特异性单一阳性信号条带（见图4）。

3 讨论

PE为单链蛋白，全长由613个氨基酸组成，包括3个不同结构域，即受体结合区（DomainI）、跨膜区（DomainI I）和催化区（DomainI I I）[5]。DomainIa具有细胞结合识别能力，DomainIb功能目前尚不清楚，大部分氨基酸的缺失不影响其毒素分子活性，DomainI I具有跨膜转运功能，DomainI I I具有ADP核糖基化活性，能抑制蛋白质合成，是PE细胞毒性作用的主要依赖区[6]。将PE的Ia区缺失即得到PE40，将它直接与靶向分子融合即可构成选择性杀伤特定靶细胞的免疫毒素，但由于其相对分子质量较大，肿瘤组织穿透力较低[7]，影响肿瘤靶向治疗的效果。进一步将PE的Ib区去掉，得到的PE38相对分子量较小[8-9]，将PE催化区最后5个氨基酸REDLK突变为KDEL，可提高其进入细胞的跨膜能力，增强毒素作用的活性，使免疫毒素更具杀伤力[10]。BRINKMANN等[11]研究发现，由多种人类肿瘤相关抗原的鼠源单抗B3制成的免疫毒素B3（Fv）-PE40和B3（Fv）-PE38KDEL对多种肿瘤细胞均有杀伤作用，均可使肿瘤组织块缩小甚至消退，而修饰改造后的PE38KDEL分子杀伤肿瘤细胞的作用更强。故本研究将PE38KDEL作为研究对象。

图1 重组质粒pET32a（+）/PE38KDEL构建及酶切鉴定

图2 pET32a（+）/PE38KDEL重组质粒原核表达

本研究对PE38KDEL基因进行原核密码子优化，使目的基因更适合于原核表达，以利于增加蛋白表达量。密码子优化协调是进行蛋白质异源系统表达常用的手段。经过密码子优化的异源系统表达可实现目的蛋白的高产量，同时保证表达系统稳定性[12-13]。密码子优化协调有多种方法，不同优化方法作用下蛋白表达效果差异较大。目前常用的密码子优化方法有：改造宿主、稀有密码子替换、异源表达宿主的选择或同源表达、密码子对优化、密码子对协调等[14]。根据以上理论和设想，并通过在线（http://www.jcat.de）预测，本研究对PE38KDEL重组蛋白原核密码子进行了密码子对优化，并进行了原核表达，获得了较高的目的蛋白表达。

免疫毒素由毒性蛋白和相应配体（生长因子、抗体等）连接在一起组成，其配体可以与一种靶细胞抗原结合，在配体的靶向介导下，免疫毒素被细胞逐渐内吞并通过其连接的毒素部分达到杀伤靶细胞的目的[15]。自1999年美国FDA批准免疫毒素ONTAK（DAB389-IL2）上市用于治疗成人皮肤T细胞淋巴瘤[16]以来，肿瘤免疫毒素靶向治疗研究成果显著。目前，国外基于PE38KDEL构建的免疫毒素已有15种进入了I期临床试验[17]。本研究制备的PE38KDEL蛋白为进一步研究免疫毒素提供了基础。

图3 PE38KDEL重组蛋白免疫后兔血清抗体的反应和效价检测

图4 Westernblot法检测PE38KDEL兔血清抗体的特异性

单克隆抗体因具有高度特异性而在临床和基础研究方面广泛应用。由于单克隆抗体仅能够识别一个B细胞表位而具有其应用的局限性，因此多克隆抗体的制备和研究仍然有较广的应用前景。徐悦玥等[18]通过原核优化表达肺炎链球菌表面蛋白A并通过纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔，制备了高纯度和高效价的多克隆抗体，具有快速检测肺炎链球菌的应用价值。本实验室通过同样方法制备的人乳头瘤病毒E7蛋白的多克隆抗体，具有特异性强和效价高的特点，不仅可识别宫颈癌Siha细胞和Caski细胞株中的天然HPV16E7蛋白，也可识别HPV16E7重组蛋白，可应用于HPV16E7的检测[19]。因此，针对多个B细胞抗原表位的多克隆抗体仍具有研究的意义和必要性[20]。

综上所述，本研究利用密码子对优化的方法设计了PE38KDEL基因，通过原核表达系统获得了PE38KDEL重组蛋白，进一步将该重组蛋白作为特异性抗原免疫日本大耳白兔，获得了高效价血清多克隆抗体，经ELISA法检测其效价达到1:60000，经Westernblot法检测其能特异性识别PE38KDEL蛋白。本研究制备的多克隆抗体，具有制备过程短、特异性强、成本低和抗体效价高等优点。

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（本文编辑：丁敏娇）

Prokaryotic expression of recombinant PE38KDEL protein and preparation of its polyclonal antibody

CEN Danwei, SONG Yiling, ZHANG Chanqiong, MAO Shanshan, YE Xiaoxian, CHEN Jun, CHEN Shao, ZHU Shanli, ZHANG Lifang. Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To prepare PE38KDEL recombinant protein from Pseudomonas exotoxin A in prokaryotic expression system and prepare the PE38KDEL specifc polyclonal antibody.Methods:The C-terminal 609-613 amine acid REDLK from Pseudomonas aeruginosa exotoxin (PE) genes (PE38) was mutanted to KDEL. After prokaryotic codon optimization (http∶//www.jcat.de), the full gene sequences were synthesized and then cloned into expression vector pET32a (+) prokaryotic expression vector inserted into Hind III and Xho I and constructed the recombinant plasmid pET32a (+)/PE38KDEL. After sequenced, the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl beta-D-1-thiogalactoside (IPTG) to get the PE38KDEL protein. The recombinant protein was purifed by Ni-NTA affnity chromatography, SDS-PAGE and Western blot were used to identify it. Then, the rabbits were immunized by the PE38KDEL purifed protein. The sera were collected before and after immunized. The antibody reaction and titer were detected by ELISA.Results:The pET32a (+)/ PE38KDEL recombinant plasmid was successfully constructed and the protein was expressed and purifed in the prokaryotic expression system. The protein molecular weight was about 57 kDa which was in accordance with the expected theoretical value. The PE38KDEL polyclonal antibody was obtained by immunization of rabbits and the titer of it was as high as 1∶60 000.Conclusion:The PE38KDEL recombinant protein can induce the rabbit to produce serum polyclonal antibody which has high titer and strong specifcity and can be used for further study which laid a solid foundation on the biology and immunology function.

Pseudomonas aeruginosa; exotoxins; PE38KDEL; polyclonal antibody; rabbits

R3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.001

2016-05-13

国家自然科学基金资助项目（81372447）。

岑丹维（1991-），女，浙江舟山人，硕士生。

张丽芳，教授，博士生导师，Email：wenzhouzlf@126.com。