胆汁酸盐输出泵BSEP/ABCB11研究概述*

高 飞，谈欣乐，闵秋霞，陈家春△

华中科技大学同济医学院药学院 1中药学系 2药理学系，武汉 430030

综 述

胆汁酸盐输出泵BSEP/ABCB11研究概述*

高 飞1，谈欣乐2，闵秋霞1，陈家春1△

华中科技大学同济医学院药学院1中药学系2药理学系，武汉 430030

胆汁酸和胆盐类； 离子通道

胆汁是一种内源性的复杂的混合物，其成分包括胆汁酸盐、胆红素、磷脂、氨基酸、类固醇、卟啉、维生素和重金属等，其中胆汁酸盐约占67%[1]。胆汁酸由肝脏中的胆固醇合成而来，并作为胆汁的主要成分储存于胆囊中。人体进食后，十二指肠分泌肠促胰肽酶即缩胆囊素，促进胆囊收缩进而使胆汁分泌进入肠道系统[2]。胆汁作为一种消化液，能乳化脂肪，帮助机体对脂肪的消化和吸收，同时还能促进小肠对脂溶性维生素等物质的吸收。另外，胆汁还能促进机体对脂溶性代谢废物的清除，包括多余的胆固醇、亲脂性的毒素或药物。胆汁功能的正常发挥依赖于胆汁酸的肝肠循环代谢途径。在肝肠循环中，约90%～95%的胆汁酸盐可被肠壁重吸收后经门静脉重回肝脏，经肝细胞处理后，与新合成的结合胆汁酸一道再经胆道排入肠道。另外约5%的胆酸盐则经粪便排出[1]，此过程是清除体内胆固醇的重要途径。对人类而言，体内一般每天进行6～10次肝肠循环，以维持机体正常的新陈代谢。

人体每天需要分泌适量胆汁酸用于清除体内的胆固醇。因此，高效运转的胆汁酸转运系统对于确保该过程的进行尤为关键。涉及到的胆汁酸转运体主要包括肝脏中的胆汁酸盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)，牛磺胆酸钠共转运多肽(sodium-taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP)[3]和有机阴离子转运多肽(Na+-independent organic anion transporting polypeptides，OATPs)[4]。其中，BSEP是肝脏分泌胆汁酸盐的主要转运蛋白。该蛋白属于三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette,ABC)超蛋白家族中的一员，位于肝细胞顶端胆小管侧质膜上，对于胆汁酸盐依赖的胆汁流向和胆汁的整个肝肠循环具有关键作用。因此，BSEP参与的过程是整个肝肠循环的限速步骤。基因突变会造成BSEP蛋白合成或转运缺陷，进而导致胆汁流动障碍，称为胆汁郁积。本文以BSEP的研究进展为切入点，对其蛋白结构及功能进行概述，同时对整个蛋白表达的调控机制和影响因素进行总结，并对由BSEP基因突变引起的几种胆汁郁积的疾病作简要概括，为临床诊疗和对其他物种BSEP蛋白结构功能及与胆汁代谢调控的深入研究提供指导。

1 BSEP的发现及结构与功能

1.1 BSEP的发现

胆汁酸盐的分泌是胆流形成的驱动力，也是肝脏从血液中清除胆汁酸盐的限速步骤。在肝脏胆小管侧细胞膜内外存在大约-35 mV的电化学梯度，被认为是胆汁酸分泌入胆汁的原驱动力[5-6]。然而，研究发现胆汁中胆酸盐的浓度是血浆中的100～1 000倍，仅仅具有该电化学梯度并不足以克服如此巨大的浓度差别[2]。后续研究发现该转运过程消耗ATP，并依赖于胆汁酸转运体[7]，后将其命名为胆汁酸盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)，并对其编码基因及蛋白的结构和功能进行探索和研究，整个过程历经几十年。

1995年，Childs等[8]研究人员从多药抗药性蛋白P-糖蛋白(MDR1)的基因序列中设计探针，在猪肝脏中的cDNA库中获得BSEP基因的部分序列。1998年，ABCB11的完整编码序列在大鼠中首次得以鉴别和认证，并因其以肝脏胆汁酸盐输出为主要特征，将其命名为胆汁酸盐输出泵[9]；对人类肝脏中BSEP蛋白的研究在1999年至2012年取得了重大进展，发现其由1 321个氨基酸组成，分子大小为160 kD，其编码基因位于染色体2q24上，其基因的突变与进行性家族肝细胞内2型进展性家族性肝内郁积(PFIC-2)密切相关[10]；2000年，研究发现啮齿类动物BSEP与人类BSEP相比有约80%的同源性[11]；2000年，研究发现鳐科低等脊椎动物海洋鱼(Skate)与人类BSEP相比仅有约69%的同源性，且分子大小为210 kD[12]；2003年，Langmann等[13]通过实时定量反转录PCR的方法检测47个已知的人类ABC转运体超家族蛋白在人体20个不同组织中的分布情况时，发现BSEP/ABCB11在肝脏中表达较高。1995年至今，研究人员逐步发现通过对BSEP进行翻译后修饰(如蛋白的糖基化、磷酸化、泛素化)能在不同程度上影响其功能的发挥[14-15]。总之，自1995年发现BSEP/ABCB11以来，人们对其编码基因、蛋白结构、功能等都进行了更加深入细致的研究，这些研究成果都为后续的研究工作奠定了坚实的基础。

1.2 BSEP的结构

人类BSEP由ABCB11基因编码,ABCB11基因有28个外显子，其中第1个外显子不翻译，其余27个为编码外显子[16]。其cDNA包含5 036个碱基对，其中3 963 bp为开放阅读框[9]，编码蛋白氨基酸序列。BSEP属于典型的ABC转运体家族成员，具有ABC家族的串联复制结构，有12个跨膜区域(TMD)与2个大的细胞质核苷酸结合区域(NBD)，以TMD-NBD-TMD-NBD的结构存在[15]，此外具有典型的Walker A/B序列及ABC家族的特征序列[11]。胆酸盐转出泵属于糖蛋白，由1 321个氨基酸组成，大小为160 kD，比预测的主体蛋白稍大，主要是由于蛋白的糖基化所致[10]。2012年，Kubitz等[16]通过同源建模的方法模拟了人类BSEP蛋白的三维立体结构，从分子水平上提出BSEP中包含12个跨膜螺旋和2个大的核苷键合区域。

1.3 BSEP的功能

人类胆汁酸主要由胆酸(CA，50%)、细菌代谢产物脱氧胆酸(DCA，20%)和替代途径产生的鹅去氧胆酸(CDCA，30%)组成。胆汁酸在肝细胞中合成后会与甘氨酸和牛磺酸结合，在正常情况下，结合型的胆汁酸经BSEP分泌至胆汁中[17]。转运过程中BSEP与各种胆汁酸盐结合的亲和力和转运次序存在差异，亲和力大小顺序为：牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)=牛磺胆酸(TCA)>牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)=牛磺脱氧胆酸(TDCA)>甘氨胆酸(GCA)=胆酸(CA)[9]。BSEP是三磷酸腺苷(ATP)依赖型蛋白，负责将胆汁酸转运出肝细胞外。在胆汁酸与核苷酸酶(ATPase)结合后，ATPase被激活，进而诱导BSEP的表达，使该蛋白的转运功能得以实现，其中TCDCA与该转运蛋白的亲和性最好，是激发ATPase活性的最好的诱导剂，即TCDCA的转运活性最高[18]。

BSEP的转运功能缺陷会导致胆酸盐依赖型胆汁的分泌紊乱，逐渐发展为多种胆汁郁积的疾病，最终导致肝功能衰竭。但是BSEP基因敲除的小鼠相比对照组小鼠，胆汁分泌只减少了25%，仅引起中度胆汁郁积，不足以引起严重的胆汁郁积和肝功能衰竭[19]。因此进一步研究BSEP转录活性的抑制机制有助于多种胆汁郁积疾病的预防和治疗。

目前已有多种BSEP活性检测的方法用于检测其转运胆汁酸的功能，这些检测方法包括：昆虫细胞(Sf9)膜囊泡检测体系[20]、人源或鼠源的胆小管膜囊泡检测体系[21]、三明治培养(sandwich-cultured)肝细胞检测体系[22]、BSEP/NTCP双重转染的猪近端肾小管上皮细胞(LLC-PK1)检测体系等。在这些细胞体系中将BSEP过表达，检测其转运胆汁酸的功能，根据米凯利斯-米氏动力学计算方式计算BSEP转运胆汁酸的动力学参数来评价其转运活性的高低。其中膜囊泡检测体系操作简便，是最常用的检测BSEP转运活性的体系，但是该检测体系不能准确评价原位药物代谢过程，因此如果当药物代谢产物引起BSEP功能抑制时，检测结果为假阴性结果；而当药物会迅速降解成无活性的代谢产物时，检测结果则为假阳性结果。且BSEP/NTCP双重转染的细胞检测体系亦会发生上述同样的情况。而三明治培养肝细胞检测体系则需要较长的细胞培养周期，这一缺点大大限制了转运活性的检测通量及重现性。2016年，研究者提出了一种新的胆酸盐转运活性检测方法，在代谢能力旺盛的原始肝细胞悬浮液中将胆酸盐前体物质通过原位生物合成生成各种初级及次级胆酸盐，同时采用液质联用(LC-MS/MS)技术检测被转运到细胞基质中的各种胆酸盐含量[23]。实验证明这种新的检测胆汁酸转运活性的技术能够克服以上几种检测方式的技术缺陷，对于研究BSEP的转运功能具有广泛的应用价值。

2 BSEP组成型表达

BSEP是胆汁在整个肝肠循环中的关键转运体蛋白之一，蛋白合成后最终被靶向定位于肝细胞胆小管侧顶端质膜，其主要负责将肝细胞中的胆汁酸盐分泌至胆道系统中。

BSEP在高尔基体合成且经过转录后修饰之后，首先直接运输至顶端的囊泡(核内体)中，在囊泡中滞留几小时后再转移至顶端质膜[24]。该过程由p38 MAP激酶(p38 MAP kinase)和蛋白激酶C(protein kinase C)共同激活[25]。此外，动力蛋白二型肌球蛋白调节轻链(motor protein myosin Ⅱ regulatory light chain，MLC2)能够与BSEP的核苷酸结合域(NBD)相互作用，协助BSEP被运输到肝细胞胆小管侧的顶端质膜上[26]。

肝细胞胆小管侧的顶端质膜上存在富含胆固醇和鞘磷脂的一种特殊膜结构(脂质筏)形成的膜微区，且该区域表达小窝蛋白-1/2(caveolin-1/2)，这些结构对肝细胞胆小管侧顶端质膜起保护作用，使之免受高浓度胆汁酸的损害[27]。其中，若肝细胞中小窝蛋白-1/2过表达，由BSEP驱动的胆汁酸盐的分泌则会显著增加[28]。由此可见，脂质筏结构和小窝蛋白-1/2的存在，对BSEP分泌高浓度胆汁酸盐这一功能的发挥奠定了结构基础。

BSEP合成后最终被定位于肝细胞胆小管侧的顶端质膜，但其半衰期仅为4～6 d，该蛋白在肝细胞胆小管侧的顶端质膜和核内体之间不断地循环[29]，即BSEP在持续地从核内体释放运输到肝细胞胆小管侧的顶端质膜上再被核内体内化，处于一种动态平衡当中。

在这种以内化作用介导的动态平衡中，细胞骨架相关蛋白(Hax-1，HCLS1-associated protein X-1)发挥着重要作用。其可与BSEP结构当中的核苷酸结合域(NBD)相结合，且Hax-1同时与皮动蛋白(cortactin)相互作用。三者关系具体表现如下：将Hax-1敲除或将皮动蛋白过表达后，肝细胞胆小管侧的顶端质膜上BSEP的表达随之上升，即内吞作用减少，原因是Hax-1协助BSEP的内化而皮动蛋白阻碍其内化作用[30]；其次，BSEP分子本身C端尾部序列当中的酪氨酸序列(1310YYKLV1314)亦可促进BSEP的内化作用，这种序列在多种同源性高的ABC蛋白家族当中高度保守，该序列能够介导ATP依赖的底物转运，且具有广泛的底物亲和性。此外C端尾部酪氨酸序列能够直接与AP-2相互作用，而AP-2是与依赖发动蛋白和网格蛋白的细胞内吞作用相关的衔接蛋白，即为1310YYKLV1314促进BSEP的内化提供间接证据[31]。另外若Ca2+依赖型受体-二型肌糖1，4，5-三羟甲基氨基甲烷磷酸盐受体(InsP3 R2：the type Ⅱ inositol 1，4，5 trisphosphate receptor)的表达量减少，也会导致BSEP内化的增加，进而减少胆酸盐的分泌[32]。

综上所述，细胞骨架结合蛋白Hax-1、皮动蛋白、BSEP分子本身C端尾部序列当中的酪氨酸序列1310YYKLV1314、Ca2+依赖型受体-二型肌糖-1，4，5-三羟甲基氨基甲烷磷酸盐受体均可通过影响BSEP的内化过程进而调节BSEP的分布和定位，即在不同程度上调节BSEP的组成型表达。

3 BSEP诱导型表达

BSEP除了以上组成型表达之外，也能够被多种因素调控进行诱导型表达，通过对BSEP在细胞膜上表达量的控制以应对短期内不同状况的胆汁酸转运需求。例如：牛磺熊去氧胆酸可以诱导BSEP镶嵌在肝细胞胆小管侧的顶端质膜上[33]，该过程中p38 MAP激酶和蛋白激酶C介导的转导通路是被TUDCA激活后将BSEP从核内体运输至顶端质膜的关键步骤。在由牛磺胆酸盐调控的BSEP内化过程中涉及到磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)、肝脏激酶B-1(liver kinase B1，LKB1)，且LKB1是一种被胆汁酸激活的上游激酶，进而促进BSEP的靶向定位。

相反，雌二醇-17b-葡糖苷酸、石胆酸、脂多糖等物质或组织缺氧等现象的发生均会促进BSEP内化，导致肝细胞胆小管侧细胞质膜上的BSEP减少，进而引起减少胆汁酸的分泌，最终导致胆汁郁积的相关疾病。虽然其具体调控机制尚未完全清楚，但是部分路径已被阐明。如，牛磺石胆酸通过PI3K依赖型蛋白酶C激活的路径，实现BSEP的靶向定位[34]；此外，石胆酸是FXR的激动剂，因此能够实现BSEP基因表达的下调；雌二醇-17b-葡糖苷酸是通过影响由钙离子依赖型蛋白激酶C(PKC)及PI3K激活的信号通路而引起胆汁郁积[35]；而脂多糖诱导的胆汁郁积是通过诸多细胞因子的调控而获得，如白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素1A(IL-1A)和肿瘤坏死因子(TNF)[36]。

4 BSEP的调控模式

BSEP表达的高低受多种因素的调控。一般来讲，其转录水平的表达情况受到多种调控因子(例如FXR、SRC-2、LKB1、Lrh1、Nrf2等)的长期调控；此外，在应激条件下，机体通过蛋白的内化等作用调节其在肝细胞胆小管侧的顶端质膜上的半衰期的长短，进而实现对BSEP的瞬时调控。

4.1 长期调控

BSEP在人体中的表达水平存在个体差异，其转录水平表达的高低受到多种调控子的长期调控。其主要调控子包括：法尼酯X受体(farnesoid X receptor，FXR)、类固醇受体共激活物-2(steroid receptor coactivator-2，SRC-2)、肝细胞激酶LKB1(liver kinase B1，LKB1)、核转录因子等。

FXR与视磺酸受体(RXR)共同作用下通过反式激活BSEP转录启动子来促进BSEP转录水平的表达。胆汁酸不仅是FXR的生理性配体，并且能够调控其自身转运体的翻译工作[37]。鹅去氧胆酸(CDCA)是FXR的主要内源性生理配体，能够促进BSEP共激活复合物(ASCOM)从而导致BSEP启动子区域组蛋白甲基化，进而激活FXR依赖的BSEP表达。

SRC-2也能够与FXR激活的BSEP启动子相互作用，通过AMP激活蛋白激酶(AMPK)磷酸化途径将BSEP的转运功能激活。SRC-2本身具有内在的乙酰转移酶活性，其结合到基因启动子区域，造成该区域组蛋白乙酰化，增加了可转录的基因数[16]。经研究证明，BSEP的mRNA水平和蛋白水平的表达在肝细胞SRC-2基因敲除的小鼠当中表达量显著降低，但是SRC-1和SRC-3敲除的小鼠体内未观察到显著变化，表明SRC-2可以提高BSEP转录水平的表达。

LKB1可于AMPK激活通路的上游起作用同时也能激活AMPK激酶家族的其他蛋白激酶[16]，一定程度上提高依赖于ATP的BSEP蛋白水平的表达。

肝脏受体类似物1(Lrh1)是胆固醇合成胆汁酸的限速酶即胆固醇7-α-羟基化酶(CYP7A1)的主要调控蛋白，同时也涉及BSEP的调控过程。实验表明，在肝脏Lrh-1敲除的小鼠当中，BSEP表达和胆汁酸合成受阻同时被观察到。说明Lrh1促进胆汁酸的合成与BSEP转录水平的表达[38]。

核转录因子(Nrf2)能正向调控BSEP转录水平[39]。Nrf2是氧化应激的感受器，能够抵消由毒性胆汁酸产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，Nrf2结合于BSEP转录启动子附近的肌肉腱膜纤维识别原件(MARE)，即位于转录启示位点的近两百个碱基附近，在一定程度上调控BSEP转录水平的表达。

4.2 瞬时调控

应激条件下，BSEP为应对环境的改变，通过从胆小管侧膜上结合、脱落以及内化来实现短期调控，这也是胆汁酸短期合成的主要机制[40]。这种对环境应激而产生的短期调控使BSEP的表达量以及最大转运速率能够根据实际需要在数分钟内完成调整。如当肝细胞水合作用、激素、胆汁酸盐或者氧化应激生理条件发生变化的时候，此效应即可生效[16]。在其所有影响因素当中，细胞体积是关键影响因素，由渗透压差、氨基酸摄取、胰岛素或者乙醇等刺激导致的细胞体积的增长，均能够增加微管依赖型胆汁酸盐的分泌，并且迅速将核内体中BSEP释放到肝细胞胆小管侧顶端质膜上，使其转运功能得以正常发挥[41]。

5 BSEP基因缺陷相关的疾病

随着基因组学的发展，研究人员发现与BSEP/ABCB11有关的遗传变异、单核苷酸多态性(SNPs)均可能导致BSEP功能缺陷，从而引发各种胆汁郁积相关疾病。已有研究表明，BSEP突变相关的疾病有二型进行性家族性肝内胆汁郁积(progressive familial intrahepatic cholestasis typ-2，PFIC-2)[42]，二型良性复发性肝内胆汁郁积(benign recurrent intrahepatic cholestasis，BRIC-2)[43]，药源性胆汁郁积(drug-induced cholestasis，DIC)[44]和妊娠期肝内胆汁郁积(intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP)[45]，需要采用合适的途径来预防和治疗BSEP基因突变引起的不同类型的胆汁郁积疾病。

PFIC-2是由BSEP突变导致的一种胆汁郁积病症，该病患者通常为婴幼儿，典型症状为黄疸、瘙痒和生长障碍，同时一些婴儿也能发展出严重的维生素K缺乏导致的出血倾向。与其他小儿疾病相比，PFIC-2患者易发生血清低胆固醇症[46]。更危险的是PFIC-2患者肝细胞癌变的几率也大得多[47]，另有研究表明，胰腺癌病例也曾发生在PFIC患者上，推测PFIC-2患者可能罹患胰腺癌的几率要高于其他人群[48]。

BRIC-2也是一种BSEP相关的肝脏胆汁郁积症，其典型症状是自限性胆汁郁积和低含量的γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)，且易引发胆结石。但是因为相比PFIC-2来讲其对人体或动物的健康威胁要相对较小，故而命名为良性复发性肝内胆汁郁积症[16]。

ICP为另一种有关BSEP基因突变造成的疾病，其和BRIC-2与PFIC-2相比，仍保留了部分BSEP活性。该病患者中BSEP遗传突变是患病的主要因素[49]，同时雌激素的代谢产物及黄体酮是其发病的主要诱因。ICP患者最典型的特征是瘙痒，只有约10%的患者会出现黄疸。ICP在不同地理区域分布比例有巨大的差别。在ICP患者中雌激素和硫酸化黄体酮的代谢产物均会增加[16]。相比正常人群而言，父母含有纯和的p.V444 A等位基因多样性者很有可能发展为妊娠期肝内胆汁郁积[50]。

p.V444 A不仅与ICP相关联，且可引发DIC。ICP和DIC二者均是因为等位基因多样性p.V444 A导致BSEP的表达降低，进而引起胆汁酸分泌功能障碍，最终引起胆汁郁积。利托那韦、环孢菌素A、辛伐他汀、维拉帕米等药物均可通过抑制BSEP的功能引起胆汁郁积[16]。

总体来说，位于肝细胞顶端胆小管侧膜上面BSEP/ABCB11在这些疾病中的表达高低顺序为DIC>ICP>BRIC2>PFIC2[51]。

BSEP/ABCB11作为胆汁酸转运的关键蛋白，对维持肝脏的胆汁酸平衡、肠肝循环稳态及对食物中脂质的消化具有重要作用。另外，研究还发现胆汁酸激活的核受体FXR能控制肝脏的糖脂代谢，因而BSEP/ABCB11极有可能通过控制循环系统中胆酸盐浓度，维持人体能量稳态和脂质代谢稳态。

随着近年来对于BSEP的研究突飞猛进，目前已有基于跨膜螺旋预测工具对于BSEP的晶体结构的预测，需要进一步提纯并直接观察其分子构型来验证该模型的准确度；基于BSEP转录调控的研究，通过建立BSEP在肝细胞内转运及调控关系网络，将大大有助于理解BSEP的调控机制；对BSEP转录水平的表达情况及翻译后修饰的研究已逐渐引起重视；临床案例中，BSEP的编码基因(ABCB11)发生突变，很可能会导致BSEP的转运功能障碍，进而引起不同程度的胆汁郁积，最终引起肝功能衰竭，严重威胁人类健康状况和生活水平。寻找新型药物靶点对于预防、改善或者逆转这些疾病进程具有重大意义，例如：通过转录因子的调节使BSEP的表达在BRIC-2患者体内上调，可补偿该蛋白的部分活性损失；开发拮抗相关致病性药物活性的靶向制剂可以延缓DIC患者的发病过程或者预防DIC的出现。作为药学工作者，应在药学研究领域对BSEP的表达调控、代谢机制、转运功能、基因突变等进行深入的研究探讨，重点从引起胆汁郁积的多种复杂因素着手，收集更多的临床资料和证据来验证BSEP/ABCB11的调控机制，为相关的基因缺陷所导致疾病的研究和临床应用、以及精准治疗提供更加科学准确的用药指导。

BSEP/ABCB11对于人体及啮齿类动物胆汁酸的转运与调控机制已有较为明确的阐明，但对于其它类动物的作用还知之甚少。熊胆、蛇胆和天然牛黄等胆汁类中药在我国具有悠久的药用历史和巨大的药用价值[52]。胆汁酸(如UDCA，CDCA，TUDCA，TCDCA等)是胆汁的主要成分，具有多种药理活性[53]。胆汁酸肝肠循环调控机制的相关研究表明胆流形成的主要动力是胆汁酸盐从肝细胞的分泌，而此限速步骤主要依赖于胆汁酸盐输出泵(BSEP)功能的正常发挥。因此，通过对BSEP的结构、功能、分布、表达等的研究，以建立对于传统胆汁类中药的现代质量评价体系和指导胆汁类中药材的现代化生产也具有重要意义，对于此领域的研究尚需深入开展。

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(2016-02-22 收稿)

*国家自然科学基金资助项目(No.81373917)

高 飞，女，1990年生，医学硕士，E-mail：799802236@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：homespringchen@126.com

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10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.023