锌指蛋白703的结构和功能

李丁综述刘阁玲审校

（1.华北理工大学研究生院，河北唐山063007；2.河北医科大学附属唐山市工人医院内分泌一科，河北唐山063000）

锌指蛋白703的结构和功能

李丁1综述刘阁玲2审校

（1.华北理工大学研究生院，河北唐山063007；2.河北医科大学附属唐山市工人医院内分泌一科，河北唐山063000）

本文简述了锌指蛋白703(ZNF703)的结构域及其功能，初步探讨了ZNF703在肿瘤中的关系及作用机制，为临床诊断、预后及药物治疗提供一定的研究价值。

ZNF703；蛋白结构域；雌激素；肿瘤

恶性肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一。近年来，通过分子领域研究肿瘤发生机制受到国内外学者的广泛关注。锌指蛋白是一类具有指状结构的转录因子，在真核生物中广泛表达，参与细胞的分化、增殖和凋亡等重要生命过程[1]。人类锌指蛋白703 (ZNF703)为新发现的锌指蛋白家族成员。国外学者通过扩增人类染色体8p11-12区域，发现ZNF703基因与乳腺癌的发生及发展密切相关[2]。随着国内外研究的深入，目前已经证实ZNF703在人类乳腺癌、大肠癌、胃癌及子宫内膜癌等均存在异常表达。本文拟通过阐述ZNF703的研究现状，分析其在肿瘤发生发展中的作用。

1 锌指蛋白简述

锌指蛋白因含锌指结构而得名，该结构是由锌离子与若干保守的氨基酸残基结合，形成的指状四面体结构。这一结构最早由Miller等[3]于1985年在非洲爪蟾转录因子TFⅢA中发现。随后人们在哺乳动物、植物、果蝇、病毒中均发现此类含有锌指结构的蛋白，人们把这类蛋白质统称为锌指蛋白。锌指蛋白可通过锌指结构，与其他蛋白形成转录复合物，结合目标启动子而发挥调控作用。当锌离子被其他等金属离子置换后，锌指结构将不能形成稳定的折叠，显著降低了与其他DNA的特异性结合。由此可见，锌离子可通过维持锌指结构的稳定性，保证了锌指蛋白功能的有效性[3]。锌指蛋白在哺乳动物的细胞内含量丰富，据统计大约有2%的人类基因编码锌指蛋白[4]。锌指蛋白可根据组成锌指结构的保守氨基酸残基Cys和His的不同组合，分为C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H以及联合型等多种类型[5]。锌指蛋白通过锌指结构结合DNA、RNA、DNA-RNA杂交双链分子、蛋白质及其自身，从而在转录及翻译水平上发挥对靶基因的调控作用[6]。

2 ZNF703/NLZ1的蛋白结构域

2.1 ZNF703/NLZ1蛋白简介NET蛋白属于锌指蛋白亚家族，需要结合Groucho家族蛋白、组蛋白脱乙酰基酶1和2[(Histone Deacetylases(HDAC)1and 2)]形成转录抑制因子复合物[7]。Ji等[8]认为NLZ1/ZNF703属于NET蛋白亚家族成员，并证明了在斑马鱼的胚胎组织中NLZ1特异性结合在GAL4(Groucho蛋白家族成员)基因的启动子上。Castro等[9]发现ZNF703/NLZ1基因在人类及小鼠体内广泛表达，比较了三种人类ZNF703/NLZ1mRNA(根据大小分别命名为mRNA1、mRNA2、mRNA3)的序列，发现他们的区别仅在于3'-UTR的长度。此外Castro等[9]还证明了可变聚腺苷酸产生了不同的NLZ1基因亚型，进而调节蛋白在组织及物种表达量上的差异。

2.2 NLZ1/ZNF703结构域的功能NLZ1/ZNF703包含六个进化上的保守结构域，其中早已知的三个结构域为SP结构域、圆头盒(BTD)结构域及C2H2锌指结构域，均存在于NET家族蛋白与SP家族蛋白中[10]。新近发现的三个结构域为NET蛋白家族所特有，Castro等[9]根据上述三个特有结构域中含量最多的保守氨基酸，而将这三个特定域分别命名为LP、PY及YL，并发现它们在脊椎动物NET蛋白家族的两个旁系组中都具有高度保守性，故而推测这些特定域对于蛋白的生理功能有重要作用。

2.2.1 是否参与其他蛋白质的结合首先考虑到ZNF703/NLZ1特定域是否对于蛋白质相互结合发挥作用。如上所述，人类NET蛋白可特异性结合HDACs(组蛋白脱乙酰基酶)，这使人联想到ZNF703/ NLZ1特有域可能充当两者的结合位点。然而国外研究人员在几年前已经发现了ZNF703/NLZ1与HDACs的结合位置位于BTD盒结构区域和C2H2型锌指结构区域之间的氨基酸序列(Δ385-460，Δ408-589)区，ZNF703/NLZ1与Groucho蛋白的结合区域为C2H2锌指结构域内的ZI(第一锌指区)与Z2(第二锌指区)之间的一小段氨基酸序列[11-13]。但是Dorfman等[14]对于NET蛋白家族的结构域结合Groucho家族蛋白的理论提出争议，所以Castro等[9]重点检测了NLZ1特有域是否可结合Groucho家族蛋白，通过删除任一特有域，发现并不影响NLZ1与GRG5(Groucho蛋白家族成员)的结合活性，证明了NLZ1特有结构域在NET与Groucho家族蛋白的结合效应上并不产生作用，这也符合Runko等[11]和Sagerstrom等[12]早先在斑马鱼胚胎上发现的NLZ1与Groucho家族蛋白的结合区域位于锌指结构区的说法。

2.2.2 结构域的亚细胞定位功能先前的研究发现斑马鱼的NLZ1具有细胞核定位特性[15]。Castro等[9]通过构建编码MYC标志物的过表达载体来转染人类HEK293细胞系，证明了ZNF703/NLZ1主要定位于细胞核，但未发现ZNF703的NLS(核转入机制)通路。此外Castro等[9]还发现了ZNF703在细胞核中的分布基本均匀，少数点状分布。Castro等[9]通过构建ZNF703/NZL1特有域的缺失模型来观察ZNF703的亚细胞分布，LP结构域删除后，并未发现对于蛋白的核定位有影响，但令人惊讶的结果是缺失了同时包含SP及LP的结构区域，发现ZNF703在胞核中点状分布(即非均匀分布)密度增加，表明LP、SP区域可能维持ZNF703在核中的正态分布，并推测这种点状分布特性通过阻止ZNF703达到某核染质区，进一步影响其转录阻遏的作用。接下来该研究者发现PY域的缺失导致蛋白部分保留在细胞质，而YL域缺失导致完全的核排斥现象，同时删除所有的三个特定域亦有类似的结果，这表明了位于中央的PY结构域和C末端的YL结构域对于蛋白的核定位作用非常重要，尤其是YL域的作用必不可少[9]。这与Runko等[11]和Sagerstrom等[12]提出的斑马鱼Nlz1蛋白C-末端残基对于蛋白核定位是必不可少的说法一致。然而，如上所述ZNF703自身没有核定位功能，但却形成转录抑制复合物在核内发挥作用，而LY和PY对蛋白的核定位又是必要的，这表明LY和PY结构域可能结合其他蛋白质参与某已知核定位通路进入细胞核。

2.2.3 结构域对蛋白转录抑制活性的影响Nakamura等[13]表明SP结构域并不直接介导ZNF703/ NLZ1的转录抑制，但可能充当蛋白与目标启动子的结合位点。Castro等[9]使用Gal4-DBD融合物来测试不同NLZ1片段(即缺失各种结构域的片段)特异性结合其启动子的能力，发现LP和SP结构域缺失均会导致结合能力降低，间接抑制ZNF703-Gal4复合物发挥转录抑制作用，而删除YL结构域并不影响结合能力，但因为YL域缺失如上所述完全阻止了ZNF703转录复合物进入核内，所以极有可能影响ZNF703的转录抑制功能。而事实并非如此，Castro等[9]删除YL域后，发现对ZNF703/NLZ1抑制核内TCF/β连环蛋白(WNT信号通路成员)功能的影响很小，这表明ZNF703/ NLZ1可能有其他的信号通路直接作用于核内。Castro等[9]还发现了NLZ/ZNF703作为抑制剂，参与形成斑马鱼胚胎后脑的第4菱脑节。因为被ZNF703/NLZI所抑制的WNT信号通路在所有动物的胚胎发育过程中发挥关键作用[15]，证据显示该通路对生长发育的调控作用与果蝇和小鼠的NET蛋白有关[16]，所以我们相信ZNF703在调控动物胚胎发育的过程中发挥重要作用，具体机制有待研究。

3 ZNF703与肿瘤

3.1 ZNF703与乳腺癌人类染色体8p11-12区域的扩增会促进人乳腺癌的发生和进展[17]。ZNF703基因定位于人类染色体8区域(8p11.23)[18]。Reynisdottir等[19]进一步证明了ZNF703基因作为8p11-12染色体区扩张的驱动癌基因，并支持其独立扩张的作用，其扩张事件优先发生于Luminal B型乳腺癌中，还发现了ZNF703及其基因在ER(+)乳腺癌中的表达要明显高于ER(-)乳腺癌。国外学者认为ZNF703基因为Luminal B型乳腺癌的驱动基因，随着表达量升高患者的生存期缩短，预后变差[19-21]。随后来自中国的研究也证实了ZNF703及其基因在Luminal A型及其他ER阴性乳腺癌中具有致癌作用，且长链非编码基因RNA SPRY4-IT1靶向作用于ZNF703而发挥在乳腺癌中的促癌作用[22]，这也提示我们ZNF703的致癌机制是复杂的，除了雌激素调节之外可能存在其他的机制。

3.2 ZNF703与其他部位的肿瘤国内研究人员先后证明了ZNF703在人类胃癌、大肠癌、子宫内膜癌、头颈部鳞癌中均存在致癌作用，且ZNF703的高表达提示预后较差[23-26]。特别注意的是，袁莉敏等[24]发现了ZNF703在子宫内膜癌中的表达量与ER受体存在负相关性，此外毕丽红[25]发现了ZNF703在胃癌中的致癌作用可能与幽门螺旋杆菌有关，具体机制尚不明确。ZNF703基因在人体多器官均被发现扮演着癌基因的作用，这也提示我们ZNF703可能作为一种广谱的致癌因子，参与经典的致癌通路，下面我们对其作用机制进行具体阐述。

4 ZNF703的作用机制

4.1 ZNF703与雌激素相关研究证明了ZNF703受雌激素的刺激而上调，通过过表达人乳腺MFC7细胞的ZNF703基因与蛋白，观察到与ER受体蛋白相关的FOXA1和GATA3蛋白下调，ER蛋白与基因的表达和活性减少，表明ZNF703可能对于雌激素存在负反馈调节[21]，这与袁莉敏等[24]在子宫内膜癌中对ZNF703与ER受体相关性的观察结果相一致。一些研究把ZNF703基因描述为雌激素受体转录活动的目标基因，而且认为雌激素的反应元件在其启动子区域[27]。ZNF703通过AKT、mTOR信号通路，诱导ERa受体(雌激素受体a)下调，增加了雌激素受体拮抗剂他莫昔芬的耐药性[28]，而ERa基因作为一种抑癌基因，其高表达可明显改善患者的肿瘤进展，延长生存期[29]，这也解释了ZNF703表达增高提示预后差的现象。此外，ZNF703蛋白的高表达可激活非核ER通路[28]，ZNF703可激活转录因子E2F1[21]，而E2F1活性的升高可结合C-MYC(原癌基因MYC家族成员)，进一步上调EGFR受体蛋白(表皮生长因子受体家族成员)[30]，活化后的EGFR受体参与了乳腺癌非核ER效应中雌激素激活细胞膜ER受体后的信号传递[31]，ERb(雌激素受体b)mRNA的升高也可促进EGFR受体表达增高[32]，故我们推测ZNF703与ERb受体蛋白在功能上有正相关性。Spires等[33]提出了Erb蛋白表达增高导致TAM类药物的耐药性增加，这与ZNF703蛋白的作用相同，也提示了两者在功能上可能具有紧密关系。而目前对于Erb蛋白表达与乳腺癌预后的关系存在争议，国内外研究中多数学者偏向于Erb蛋白的高表达预示着临床预后良好，这与ZNF703的临床预后关系是相反的，但启示我们通过研究ZNF703调控ER的作用机制为ERb的研究提供新的思路。

4.2 ZNF703在肿瘤中的作用机制Sircolomb等[21]发现ZNF703抑制TGFβ受体的活性及E钙粘蛋白的表达，上调亲迁徙性P120连环亚蛋白表达，从而促进细胞的增殖及迁移，减少细胞间粘附。ZNF703的过度表达细胞显示出RB1磷酸化，P27kip1蛋白下调，从而上调E2F1和CCNE1(G1/S特异性细胞周期蛋白E1)的表达，诱发细胞从G1期逃避R限制点的作用而进入S期，ZNF703与DCAF7(重组人DDB1和CUL4关联因子7)、PHB2(重组人抗增殖蛋白2)以及NCOR2(人源重组蛋白)形成核受体转录阻遏复合物而调节乳腺CSC(肿瘤干细胞)的自我更新能力，ZNF703与DCAF7相互作用可能解释其对E2F1的信号的作用，具体机制有待研究。此外，相关研究也证明了ZNF703-DCAF7-PHB2-NCOR2复合物也参与ER转录过程[34]，有趣的是，PHB1/NOCR1复合物会抑制E2F1的活性[35]，但是ZNF703/PHB2/NCOR复合物上调E2F1的活性，Sircolomb等[21]认为ZNF703复合物似乎可调节E2F1的活性而不仅只有上调作用。Kwek等[36]指出人类染色体8p11-12和11q12-14之间的扩增驱动基因在乳腺癌的发生发展中存在协同作用，发现Rb/E2F通路激活可刺激CCND1(细胞周期素D1重组蛋白)诱导ZNF703活性，认为E2F1、CCND1可以上游调节ZNF703，这与Sirclomb等[21]所提出ZNF703激活E2F1转录因子的说法有差别，这也提示了ZNF703与E2F1之间的作用机制是复杂的，值得我们进一步研究。Holland等[20]发现ZNF703刺激NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)转化为成纤维细胞，而成纤维细胞是一个典型的癌基因，在人类管腔乳腺癌细胞系中有规律的扩增，增强了乳腺癌管腔细胞形成祖细胞的频率。Holland等[20]还发现ZNF703的高表达抑制TGF-β受体(转化生长因子β受体)的活性，然而有趣的是沉默ZNF703基因表达后发现TGF-β受体的活性未受影响。我们较为认同Sircolomb等[21]所提出的理论，认为CCND1和雌激素作为上游调节物，诱导ZNF703参与ER转录和E2FI转录两种途径来调节肿瘤干细胞，推测两者之间可能存在既独立又协同的通路机制。

综上所述，ZNF703为一种新发现的锌指蛋白成员，其蛋白结构与功能之间存在紧密的联系，作为转录抑制因子，在多器官均有致癌作用，其作用机制是复杂的，涉及雌激素依赖、ER转录、细胞周期及转化生长因子信号。通过研究ZNF703的蛋白结构及作用机制，对乳腺癌、子宫内膜癌的激素治疗提供一定的研究价值，有望为ZNF703基因靶向治疗肿瘤提供新方法。

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2016-07-13)

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