miR-122在胚胎干细胞/间充质干细胞诱导成肝细胞进程中的作用

丘宾明，曹殿青，胡喆

(广东医科大学附属医院麻醉科，广东湛江524001)

miR-122在胚胎干细胞/间充质干细胞诱导成肝细胞进程中的作用

丘宾明，曹殿青，胡喆

(广东医科大学附属医院麻醉科，广东湛江524001)

miR-122是一种肝脏特异性microRNA，在肝脏发育过程中扮演重要作用。本文主要介绍miR-122在胚胎干细胞诱导成肝细胞进程中的作用，miR-122并不促进胚胎干细胞向定型内胚层细胞方向分化，然而促进定型内胚层细胞/肝前体细胞向肝细胞分化和成熟，此作用与肝富集转录因子、上皮间质转化等密切关联。

胚胎干细胞；间充质干细胞；肝细胞样细胞；分化；miR-122

肝细胞是肝脏的主要成分，在胆汁生成、物质代谢、凝血、人工肝的支持、基因治疗等方面具有重要作用。然而获取成熟的原代肝细胞非常困难，一旦离开人体内环境，则会迅速丧失分化再生能力。因此肝细胞的来源和诱导形成机制成为再生医学研究亟待解决的问题。近年报道miR-122在肝脏的发生发展过程中扮演重要角色[1-2]，为解决肝细胞的诱导形成机制提供了新思路。本文就miR-122在胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)诱导成肝细胞/肝细胞样细胞进程中的作用及分子机制进行论述。

1 miR-122的生物学特性

miR-122是一种肝脏特异性微小RNA(microRNA，长度为21～23 nt的非蛋白编码RNA家族)。miR-122在小鼠胚胎发育12.5 d的胚肝细胞中开始表达，但其表达量低下，随后表达量呈单边加速上升，在出生之前达到平台期，出生后仍以舒缓的速度不断增多，直至成人肝脏中高达66 000拷贝，占肝脏总microRNA的72%[3]，此外miR-122在其他组织器官中表达极低[4]。这种表达模式在脊椎动物中高度保守[5]。

1.1 miR-122的生物合成、转录调控和转录后修饰miR-122来源于hcr基因转录本，该基因位于人18号染色体上(18q21.31)[6]。miR-122的合成过程：(1)首先以hcr为模板，在依赖DNA的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ)的作用下转录形成pri-miR-122 (约4.5 kb)；(2)pri-miR-122在Drosha的裂解下形成pre-miR-122(66 nt)；(3)pre-miR-122在转运蛋白Exportin 5的协助下转运到细胞质中，然后在Dicer的裂解作用下形成成熟的miR-122[7]。成熟的miR-122有三种亚型：miR-122a(5'-UGGAGUGUGACAAUGGU GUUUGU-3'，23 nt)、miR-122b(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGA-3'，23 nt)、miR-122ab(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'，22 nt)，还有一种miR-122ab降解产物(5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUU-3'，21 nt)，此四种形式处于动态平衡的状态[8]。pri-miR-122表达量具有昼夜节律，主要是通过REV-ERBα抑制转录而实现，但miR-122表达量基本稳定[9]。hcr基因的启动子区位于miR-122保守茎环序列上游大约5 kb处，包含若干核转录因子的结合序列(TATA-box、CCAAT-box等)，肝脏特异转录因子C/ EBPα、HNF1α、HNF3β、HNF4α、HNF6等[10]可以与其启动子相互结合从而促进/抑制hcr基因转录，其具体机制尚未阐明。FOXO1是上游的转录因子，通过与miR-122上游核心启动子区IRE位点结合，以实现调控hcr基因转录[11]，此外HNF4与FOXO1竞争性地结合到miR-122上游的核心启动子区。microRNA转录后修饰通常是在3'末端添加1～3个核苷酸。GLD-2在miR-122的3'末端添加一个非模板核苷酸，此修饰对miR-122的稳定具有重要作用。当敲除GLD-2后，miR-122大幅度降解并伴随miR-122靶基因表达升高[8]。

1.2 miR-122的靶基因和作用方式Gramantieri等利用miRbase数据库对miR-122的所有潜在靶基因进行预测和分析，发现相当大比例的靶基因是肝脏代谢相关的重要酶类，并使用荧光素酶报告基因实验予以验证，证实miR-122调控多个糖类和脂类代谢的关键基因、细胞周期调节关键基因(Cycling G1等)[12]。此外STAT3[13]、阳离子氨基酰转运蛋白-1(CAT-1)等都是miR-122的靶基因，其中STAT3是胚胎干细胞自我更新和分化的关键蛋白质，CAT-1与肝脏胚胎发育关系密切。

miR-122与靶基因的mRNA 3'非编码区不完全互补结合而导致mRNA降解或翻译抑制，从而在转录后水平调节基因的表达。与miR-122匹配的反义寡核苷酸转染Huh-7细胞后，导致数百种miR-122的靶基因表达量增多；然而miR-122与丙型肝炎病毒RNA的5'-UTR相结合，反而促进其RNA表达[14]。

2 miR-122在胚胎干细胞向肝细胞诱导分化中的作用

胚胎发育第4.5天时，囊胚期的内细胞团分化为具有原始内胚层和原始外胚层的结构[15]，原始外胚层在胚胎发育第6.5天时通过原肠胚的过程分化形成外胚层、中胚层、内胚层，这一时期的内胚层称为定型内胚层。肝母细胞开始从定型内胚层前端衍生并发展成肝憩室，然后在成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)等条件的作用下，肝母细胞迅速形成肝芽并增殖[16]，尔后在多种细胞信号诱导的共同作用下发育形成肝和胰脏[17]。ESC是从早期胚胎(原肠胚期之前)内细胞团中分离出来的一类细胞，它具有无限的自我更新、多向分化潜能的特性。无论在体外还是体内环境，ESC均能被诱导分化为机体绝大多数的体细胞，在一定条件下能够向肝细胞或肝细胞样细胞分化，其分化步骤大致可以分为三阶段：内胚层细胞阶段、成肝细胞阶段、肝细胞样细胞成熟阶段。近年报道，miR-122在ESC诱导成肝细胞的各个阶段中的作用不尽相同[18-19]，下面就miR-122在诱导肝细胞进程中的作用进行叙述。

2.1 miR-122在胚胎干细胞向定型内胚层细胞诱导分化中的作用体外培养的小鼠和人胚胎干细胞在去除饲养层以及关键细胞因子后可以自发形成拟胚体，拟胚体含有内胚层、中胚层、外胚层细胞。研究显示激活素(Activin)/Nodal信号传导通路在定型内胚层细胞形成的过程中不可或缺，在培养体系中添加Activin A后小鼠定型内胚层细胞占比可以提高到拟胚体细胞的80%，而Wnt蛋白能够诱导胚胎干细胞极化，使其产生不对称分裂，经过Wnt作用而形成的子代细胞能够彻底地朝着截然不同的方向进行分化[20]，Roelandt等[21]往培养体系中添加Activin A、Wnt3a，不降低培养基的血清浓度的情况下，在诱导分化的第6日可检测到绝大部分ESC分化成定型内胚层细胞(表达SOX17，SRY-related HMG-box gene 17)。此外，丁酸钠能够促进ESC分化为定型内胚层细胞，同时伴随着miR-122和一些肝细胞特异基因表达升高。Tzru等[18]在诱导ESC分化为定型内胚层细胞进程中过表达miR-122，然后分析基因表达谱(GSE13460)，结果显示表达升高的基因中包括HHEX(肝脏发育中具有重要作用)、CXCR4(定型内胚层标志基因)等关键基因，大约还有20%是人胚胎干细胞保持自我更新和全能性的关键基因(OCT4、NANOG、SOX-2等)。然而部分定型内胚层/肝细胞特异基因AFP、FOXA2、Albumin等表达并未升高。而在接下来的基因富集分析中发现表达降低的基因主要集中在整合素(integrin)信号传导通路中，integrin能够活化Grb2/Mek信号传导通路，因此OCT4、SOX-2等全能性基因表达并未被抑制。文献报道STAT3是miR-122的靶基因[13]，STAT3能够促进OCT4表达，此实验中ESC过表达miR-122后STAT3表达量下降，但是OCT4等基因表达反而升高，此结果可能是各方面因素共同作用所导致。表明过表达miR-122后引起的基因表达谱变化并不能使ESC向定型内胚层方向分化，而是能够延迟ESC分化[18]。

2.2 miR-122在定型内胚层细胞向肝前体细胞诱导分化中的作用肝富集转录因子(liver-enriched transcription factors，LETFs)，包括HNF1α、HNF1β、FoxA2、HNF4α、HNF6、Liver receptor homolog 1等，在定型内胚层细胞向肝前体细胞分化过程中发挥关键性作用[22]。研究发现HNF6、HNF1、FoxA2、HNF4α、CCAAT/enhancer binding protein α通过与pri-miR-122的基因启动子相互作用从而使miR-122表达量升高[10]，反之miR-122能够促进LETFs表达，其分子机制尚不明确，其中miR-122与HNF6形成正反馈机制从而导致级联反应[23]，而且HNF6能够促进其他LETFs表达，研究表明HNF6促进HNF4α表达是通过与HNF4α启动子互相结合而发挥调控作用[24]，从而促进定型内胚层细胞向肝前体细胞诱导分化。另外HNF6能够活化TGF化进activin信号传导通路，此信号传导通路与ESC自我更新和肝脏发育密切相关，Laudadio等[23]在研究定型内胚层细胞向肝前体细胞诱导分化过程中干扰miR-122，尔后检测基因表达谱，显示26个肝特异基因表达下降，反面说明miR-122对肝特异性基因具有促进表达的作用，接下来在诱导斑马鱼肝前体细胞的过程中干扰miR-122，成熟的HNF4+/2F11+细胞明显减少。

2.3 miR-122在肝前体细胞向成熟肝细胞诱导分化中的作用肝前体细胞诱导为肝细胞的方式主要有添加细胞因子(Activin A、GFG-4等)、表观遗传修饰物质(丁酸钠等)、肝富集转录因子(FoxA1、HNF4α等)等，然而这些方法普遍存在程序复杂和诱导效率低下的问题。邓小耿等[25]在改良诱导方法(添加丁酸钠、地塞米松、肝生长因子)的前提下，在肝前体细胞中过表达miR-122，发现过表达miR-122后肝前体细胞在光镜下呈现规则多边形、核大居中、部分细胞可见双核、胞浆丰富，肝特异性基因ALB、TTR、AAT、G-6-P、CK8、CYP7A1、CYF3A4的mRNA表达水平与对照组比较明显升高，其诱导成熟的肝细胞样细胞功能比对照组明显增强。另一方面，当斑马鱼肝前体细胞敲除miR-122后不能成功分化为肝细胞样细胞[26]，说明miR-122能够促进肝前体细胞的分化和成熟。人肝前体细胞过表达miR-122后，检测基因表达谱显示59个基因探针表达升高，323个基因探针表达下降，其中升高的17个基因与肝脏分化、增生和肝功能密切相关[19]，而后实验验证过程中发现肝富集基因FoxA1、HNF4a、E-cadherin、Alb、TTR、AAT、G-6-P、CK8、Cyp7a1、Cyp3a4表达明显升高，表明肝前体细胞诱导的过程中miR-122亦能够调节特定肝富集转录因子的表达，从而促进肝前体细胞分化。此外，miR-122抑制Ihh、Loxl2表达，Ihh、Loxl2促进上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)[27]，FoxA1、HNF4a在EMT和MET转化的过程中具有重要作用[28]，可能miR-122能够调节MET和EMT以致影响肝前体细胞的分化，其具体机制有待进一步研究。

3 miR-122在间充质干细胞向肝细胞诱导分化中的作用

间充质干细胞不仅能够分化为骨、软骨亦能够分化为肝细胞[29]，在培养体系中加入成纤维细胞生长因子、肝生长因子、抑瘤素M、地塞米松等能够诱导成肝细胞，而添加曲古抑菌素A能明显提高效率。王雪[30]研究发现单独使用microRNA(miR-122、miR-1290、miR-1246、miR-542-Sp、miR-424、miR-148a)能够将脐带来源的间充质干细胞诱导成为具有功能的肝细胞样细胞。另外，脂肪来源的间充质干细胞过表达miR-122后ALB、AFP、CK18、CK19、HNF4α的表达量明显增多，并且在体外实验中其诱导的肝细胞具备糖原储集和尿素合成的能力[31]。然而miR-122在此诱导过程中的分子机制未见报道，深入探索其分子机制有利于优化肝细胞的诱导方案，以提高肝细胞样细胞的质量、安全性和效率。

4 结语

肝细胞样细胞是通过诱导胚胎干细胞、诱导多能干细胞、间充质干细胞、成纤维细胞而获得。目前miR-122的研究集中在胚胎干细胞、间充质干细胞诱导成肝细胞样细胞的进程中，而在诱导多能干细胞、成纤维细胞诱导成肝细胞样细胞的进程中的作用有待探索。miR-122在胚胎干细胞向肝细胞样细胞诱导的早期并未见促进作用，在诱导的中后期表现出显著的促进作用，然而其作用机制仍不明确，有待深入研究。此外，miR-122在间充质干细胞诱导成肝细胞样细胞过程具有促进作用，鉴于间充质干细胞具有来源广、成瘤性低等独特优势，因此miR-122在解决肝细胞来源方面具有广阔的应用前景。

[1]Hsu SH,Wang B,Kota J,et al.Essential metabolic,anti-inflammatory,and anti-tumorigenic functions of miR-122 in liver[J].J Clin Invest,2012,122(8):2871-2883.

[2]Tsai WC,Hsu SD,Hsu CS,et al.MicroRNA-122 plays a critical role in liver homeostasis and hepatocarcinogenesis[J].J Clin Invest, 2012,122(8):2884-2897.

[3]Chang J,Nicolas E,Marks D,et al.miR-122,a mammalian liver-specific microRNA,is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter CAT-1[J].RNA Biol,2004,1(2):106-113.

[4]Lagos-Quintana M,Rauhut R,Yalcin A,et al.Identification of tissue-specific microRNAs from mouse[J].Curr Biol,2002,12(9): 735-739.

[5]Kozomara A,Griffiths-Jones S.miRBase:integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J].Nucleic Acids Res,2011,39 (Database issue):D152-D157.

[6]Jopling CL,Norman KL,Sarnow P.Positive and negative modulation of viral and cellular mRNAs by liver-specific microRNA miR-122 [J].Cold Spring Harb Symp Quant Biol,2006,71:369-376.

[7]Kim VN,Han J,Siomi MC.Biogenesis of small RNAs in animals [J].Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(2):126-139.

[8]Katoh T,Sakaguchi Y,Miyauchi K,et al.Selective stabilization of mammalian microRNAs by 3'adenylation mediated by the cytoplasmic poly(A)polymerase GLD-2[J].Genes Dev,2009,23(4):433-438.

[9]Gatfield D,Le Martelot G,Vejnar CE,et al.Integration of microRNA miR-122 in hepatic circadian gene expression[J].Genes Dev,2009, 23(11):1313-1326.

[10]Xu H,He JH,Xiao ZD,et al.Liver-enriched transcription factors regulate microRNA-122 that targets CUTL1 during liver development [J].Hepatology,2010,52(4):1431-1442.

[11]习杨.人肝脏特异性microRNA-122受转录因子FOXO1调控及其机制研究[D].北京:北京协和医学院,2010.

[12]Gramantieri L,Ferracin M,Fornari F,et al.Cyclin G1 is a target of miR-122a,a microRNA frequently down-regulated in human hepatocellular carcinoma[J].Cancer Res,2007,67(13):6092-6099.

[13]Xiong Y,Zhang C,Yuan J,et al.Hepatitis C virus represses the cellular antiviral response by upregulating the expression of signal transducer and activator of transcription 3 through sponging microRNA122[J].Mol Med Rep,2015,11(3):1733-1737.

[14]Jopling CL,Yi M,Lancaster AM,et al.Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA[J].Science, 2005,309(5740):1577-1581.

[15]Gasperowicz M,Natale DR.Establishing three blastocyst lineages—then what?[J].Biol Reprod,2011,84(4):621-630.

[16]Kung JW,Currie IS,Forbes SJ,et al.Liver development,regeneration, and carcinogenesis[J].J Biomed Biotechnol,2010,2010:984248.

[17]Lewis SL,Tam PP.Definitive endoderm of the mouse embryo:formation,cell fates,and morphogenetic function[J].Dev Dyn,2006,235 (9):2315-2329.

[18]Tzur G,Levy A,Meiri E,et al.MicroRNA expression patterns and function in endodermal differentiation of human embryonic stem cells[J].PLoS One,2008,3(11):e3726.

[19]Deng XG,Qiu RL,Wu YH,et al.Overexpression of miR-122 promotes the hepatic differentiation and maturation of mouse ESCs through a miR-122/FoxA1/HNF4a-positive feedback loop[J].Liver Int,2014,34(2):281-295.

[20]Habib SJ,Chen BC,Tsai FC,et al.A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro[J].Science,2013,339(6126): 1445-1448.

[21]Roelandt P,Pauwelyn KA,Sancho-Bru P,et al.Human embryonic and rat adult stem cells with primitive endoderm-like phenotype can be fated to definitive endoderm,and finally hepatocyte-like cells[J]. PLoS One,2010,5(8):e12101.

[22]Kyrmizi I,Hatzis P,Katrakili N,et al.Plasticity and expanding complexity of the hepatic transcription factor network during liver development[J].Genes Dev,2006,20(16):2293-2305.

[23]Laudadio I,Manfroid I,Achouri Y,et al.A feedback loop between the liver-enriched transcription factor network and miR-122 controls hepatocytedifferentiation[J].Gastroenterology,2012,142(1): 119-129.

[24]Odom DT,Dowell RD,Jacobsen ES,et al.Core transcriptional regulatory circuitry in human hepatocytes[J].Mol Syst Biol,2006,2: 2006.0017.

[25]邓小耿,邱荣林,伍耀豪,等.miRNA-122促进小鼠胚胎干细胞源性肝前体细胞的分化与成熟[J].中国病理生理杂志,2013,29(7): 1260-1267.

[26]徐冉冉,张从伟,曹羽,等.缺失mir122抑制斑马鱼肝脏前体细胞向肝细胞分化[J].遗传,2013,35(4):488-494.

[27]Li T,Li D,Cheng L,et al.Epithelial-mesenchymal transition induced by hepatitis C virus core protein in cholangiocarcinoma[J].Ann Surg Oncol,2010,17(7):1937-1944.

[28]Santangelo L,Marchetti A,Cicchini C,et al.The stable repression of mesenchymal program is required for hepatocyte identity:a novel role for hepatocyte nuclear factor 4alpha[J].Hepatology,2011,53 (6):2063-2074.

[29]高翔,陈广谋,黄成硕,等.骨髓间充质干细胞对继发性骨质疏松大鼠骨缺损愈合的影响[J].海南医学,2016,27(20):3269-3272.

[30]王雪.MicroRNA介导间充质干细胞向肝细胞转分化的研究[D].西安:第四军医大学,2014.

[31]Davoodian N,Lotfi AS,Soleimani M,et al.MicroRNA-122 overexpression promotes hepatic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells[J].J Cell Biochem,2014,115(9):1582-1593.

Role of miR-122 in the process of differentiation from embryonic stem cells/mesenchymal stem cells to hepatocyte-like cells.

QIU Bin-ming,CAO Dian-qing,HU Zhe.Department of Anesthesiology,the Affiliated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

miR-122,a completely conserved liver-specific microRNA in vertebrates,is essential for liver development.This article focuses on the role of miR-122 in the process of embryonic stem cells differentiation into hepatocyte-like cells.miR-122 cannot promote the differentiation of embryonic stem cells into definitive endoderm or hepatocyte-like cells,but can promote the differentiation and maturation of definitive endodermal cells/hepatic precursors into hepatocytes.The mechanism is closely related to the liver-enriched transcription factors and epithelial mesenchymal transition.

Embryonic stem cells;Mesenchymal stem cells;Hepatocyte-like cells;Differentiation;miR-122

R321

A

1003—6350（2017）16—2672—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.16.030

2016-12-15)

广东医学院博士启动基金(编号：B2012044；B2012034)

胡喆。E-mail：biohuzhe@hot mail.om