高效液相色谱法测定鸡蛋蛋黄和蛋清中的胆甾醇

2017-02-25谢娟平

浙江农业科学 2017年1期

关键词：甾醇石油醚蛋清

谢娟平

（安康学院化学化工学院，陕西安康 725000）

高效液相色谱法测定鸡蛋蛋黄和蛋清中的胆甾醇

谢娟平

（安康学院化学化工学院，陕西安康 725000）

为建立鸡蛋胆甾醇提取及含量测定的高效液相色谱法，本研究采用皂化后用石油醚萃取鸡蛋中的胆甾醇，然后用RP-HPLC法进行含量测定。试验中以Shim-pack VP-ODS柱为分离柱，以乙腈-异丙醇（70：30，V/V）为流动相，流速为1.0 m L·m in-1，柱温为30℃，检测波长220 nm。结果显示，鸡蛋中含有丰富的胆甾醇，蛋黄和蛋清的胆甾醇含量分别为5 352.5和254.1 mg·kg-1，蛋黄中的胆甾醇含量远大于蛋清中的含量。以所测得的峰面积为纵坐标，胆甾醇浓度为横坐标，线性回归方程为y=76.45x-0.052，相关系数（r）为0.999 2，重复性实验的相对标准偏差为1.32%。该方法的加样回收率为100.1%，相对标准偏差为1.02%。此方法简单，可重复性好，适合于鸡蛋中胆甾醇的含量测定。

高效液相色谱法；蛋黄；蛋清；胆甾醇

胆甾醇又称胆固醇，是动物组织细胞不可缺少的重要物质，其不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料［1］。自然界中的胆固醇主要存在于动物性食物中，植物中没有胆固醇。胆固醇在体内有着广泛的生理作用，但当其过量时便会导致高胆固醇血症，对机体产生不利的影响［2］。鸡蛋是一种高胆固醇食物，特别是蛋黄中胆固醇的含量较高，而饲料和生活环境等因素的变化可影响鸡蛋总甾醇的含量［3］。因此，测定鸡蛋中的蛋清与蛋黄胆甾醇含量，对于指导居民合理饮食具有重要意义。鸡蛋中胆甾醇含量测定的方法主要有比色法、高效液相色谱法和气相色谱法［4-6］。国家标准方法为气相色谱法，其测定结果在很大程度上受到载气纯度的影响，而比色法简单快速，但由于共存脂类也会与显色剂反应而干扰，高效液相色谱法相对而言是一种准确度、精密度都较好的方法，但其流动相的比例，色谱条件对分离结果影响较大［7-8］。本文采用皂化后用石油醚萃取鸡蛋中的胆甾醇，再用高效液相色谱法检测的方法测定鸡蛋蛋清和蛋黄中的胆甾醇含量，并通过精密度试验、重复性试验、加样回收率试验来评价该方法的可行性，以期为鸡蛋中胆甾醇含量测定提供一种操作简单，精密度较高的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-10ATVP高效液相色谱仪（日本岛津）；AR1140/C型电子分析天平（北京OHAUS公司）；KQ-600DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（RE-52A，郑州市亚荣仪器有限公司）。胆甾醇标准品；乙腈（色谱纯，批号：AS1122-001）；异丙醇、石油醚、氢氧化钾均为分析纯；无水乙醇（优级纯）；浓氨水。鸡蛋，安康市紫阳县洪山镇农户提供。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

Shim-pack VP-ODS色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈-异丙醇（70：30，V/V）；流速：1.0 m L·min-1；柱温：30℃；检测波长：220 nm；室温：25℃，每次进样20μL。

1.2.2 溶液配制

胆甾醇标准溶液：精密称取胆甾醇标准品约0.250 g，用无水乙醇溶解并定容至25 m L的容量瓶中，得胆甾醇标准液，浓度为10 mg·mL-1，作为储备液。取胆甾醇储备液0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 m L于10 m L容量瓶中，无水乙醇稀释定容，得到浓度为0、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mg·m L-1的胆甾醇标准溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，待测。氢氧化钾-乙醇溶液：精密称取氢氧化钾56.11 g，用无水乙醇溶解并定容至500 mL的容量瓶中，得浓度为2.0 mol· L-1的氢氧化钾-乙醇溶液。

1.2.3 样品处理

取安康市紫阳县洪山镇农户提供土鸡鸡蛋12批。每批10枚，随机抽取3枚，打碎，分别精密称取鸡蛋清和鸡蛋黄按下述方法操作，同法测定12批，取平均值作为样本测定值。

精密称取蛋清约30 g，加等量水，充分搅拌均匀。取上述溶液置于250 m L的圆底烧瓶中，加入2.0 mol·L-1氢氧化钾-乙醇溶液50 m L，于85℃水浴皂化45 m in，皂化过程中始终保持旋转搅拌状态，皂化液冷却至室温后，加饱和氯化钠水溶液25 m L移至分液漏斗中，用石油醚60 m L分3次萃取，将石油醚层合并，用蒸馏水30 m L多次洗涤石油醚层至pH为中性，石油醚层用无水硫酸钠脱水滤过，回收石油醚，残渣用无水乙醇定容至25 m L，超声处理30 m in，用0.45μm滤膜过滤，得蛋清样品，待测。

精密称取蛋黄约56 g，加等量水，充分搅拌均匀后加入浓氨水5.6 m L，混匀，再加入20 m L无水乙醇，混匀，用石油醚150 m L分3次提取，合并提取液，回收石油醚，置于250 mL的圆底烧瓶中，加入2.0 mol·L-1氢氧化钾-乙醇溶液50 mL，于85℃水浴皂化45 min，以下操作同蛋清处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

用LC-10ATVP高效液相色谱仪测定标准系列溶液，溶液进样为20μL，每个浓度标准溶液重复进样3次。胆固醇保留时间为11.55 min，标准溶液色谱图见图1。以峰面积为纵坐标，胆甾醇标准溶液浓度（mg·m L-1）为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为y=76.45x-0.052，相关系数（r）为0.9992，在0～120μg线性良好。

图1 胆甾醇标准溶液的色谱

2.2 精密度

取同一蛋清溶液，连续进样5次，结果胆甾醇峰面积相对标准偏差为1.92%，表明精密度良好。

2.3 重复性

取同一批鸡蛋蛋清6份，精密称定，按1.2.3节下制备供试品溶液，按样品测定方法测定其含量分别为74.48、74.52、74.59、74.55、74.83和74.71 mg·kg-1，相对标准偏差为1.32%，表明该方法的重复性良好。

2.4 加样回收率

取已测定含量的鸡蛋蛋清6份，每份约30 g，精密称定，精密加入胆甾醇适量，按1.2.3节下制备供试品溶液，按样品测定方法测定，计算回收率，结果见表1。相对标准偏差为1.02%，表明方法的准确度良好。

表1 加样回收率实验结果

2.5 样品测定

在标准溶液色谱分析条件下进样测定，以保留时间定性，峰面积定量，样品图谱见图2。结果前3批样品胆甾醇的平均含量为，蛋清中的含量为250.3 mg·kg-1，蛋黄中的含量为5 420 mg· kg-1。其余各批样品中胆甾醇的含量及12批样品平均含量见表2。

图2 蛋黄样品的色谱

表2 样品胆甾醇含量测定结果mg·kg-1

可以看出，鸡蛋中含有丰富的胆甾醇，且蛋黄中的胆甾醇远大于蛋清中的胆甾醇，所测得的鸡蛋蛋黄和蛋清的胆甾醇含量分别为5 352.5和254.1 mg·kg-1。在本文色谱条件下，用常规液相色谱法检测鸡蛋蛋黄和鸡蛋蛋清中的胆甾醇，加样回收率为100.1%，相对标准偏差为1.02%，方法简单，可重复性好。

3 讨论

随着生活水平的提高，人们越来越注重饮食健康与安全。鸡蛋是日常生活中普遍食用品和天然营养品。然而鸡蛋蛋黄中含有大量胆固醇，如果人体每天摄入量过多，则可形成高脂。因此，鸡蛋中胆甾醇的测定具有重要的意义。但是，鸡蛋中胆甾醇含量测定的国标方法为气相色谱法，其测定结果在很大程度上受到载气纯度的影响，研究报道较多的是全蛋胆甾醇含量的测定，本文成功地用常规液相色谱分别对鸡蛋蛋黄和鸡蛋蛋清中的胆甾醇进行了测定，本方法比较简单，回收率高，重复性和检测精度良好，适合于鸡蛋中胆甾醇的含量测定。

杨琴等［9］报道，白皮普通鸡蛋蛋黄和全蛋的胆固醇平均含量分别为12 760和3 402.6 mg·kg-1；王立克等［10］报道罗曼褐鸡、闽中麻鸡和淮南鸡的蛋黄中胆固醇平均含量分别为13 140、15 700和16 320 mg·kg-1；杨朋坤等［11］报道绿壳蛋和乌鸡蛋蛋黄胆固醇平均含量分别为7 550和8 990 mg· kg-1。本实验所用鸡蛋为安康当地放养的山间土鸡鸡蛋，其蛋黄的胆甾醇含量为5 352.5 mg·kg-1，明显低于上述文献报道，推测鸡蛋中胆甾醇的含量可能受鸡的品种、饲养方式、生理因素和检测方法等多种因素的影响，具体因素需进一步研究。但此结果对于指导当地居民选择性合理食用鸡蛋具有指导意义。

［1］杨月欣.中国食物成分表［M］.北京：北京大学医学出版社，2002：135-137.

［2］王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学·上册［M］.北京：高等教育出版社，2002：114-116.

［3］王晓亮，徐桂云，郑江霞，等.不同饲养方式对绿壳蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响［C］∥中国家禽科学研究进展：第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集.哈尔滨：中国农业科学技术出版社，2009：458-462.

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［5］张蓉真，李珑，刘树滔.测定鸡蛋胆固醇的高效液相色谱新方法［J］.色谱，1998，16（2）：91-93.

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［7］张旭，胡艳，蒋桂韬，等.蛋黄中胆固醇含量测定方法的研究［J］.饲料博览，2011（12）：35-38.

［8］齐永秀.高效液相色谱法测定鸡蛋蛋黄中的胆固醇含量［J］.药物生物技术，2005，12（4）：258-260.

［9］杨琴，戴瑞彤.HPLC法测定不同品种鸡蛋中的胆固醇含量［J］.农产品加工·学刊，2006，73（3）：71-74.

［10］王立克，胡忠泽，罗学振，等.不同品种鸡蛋中胆固醇含量的比较研究［J］.安徽科技学院学报，2006，20（1）：5-7.

［11］杨朋坤，卢冉，田亚东，等.绿壳蛋和乌鸡蛋胆固醇含量的测定［J］.家畜生态学报，2011，32（2）：75-79.

（责任编辑：卢福庄）