凤阳山樱桃——浙江樱属(蔷薇科)一新种

叶立新， 鲁益飞， 王 桦， 刘胜龙， 金孝锋

(1. 浙江凤阳山-百山祖国家级自然保护区凤阳山管理处，浙江 龙泉 323700；2. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

凤阳山樱桃
——浙江樱属(蔷薇科)一新种

叶立新1， 鲁益飞2， 王 桦2， 刘胜龙1， 金孝锋2

(1. 浙江凤阳山-百山祖国家级自然保护区凤阳山管理处，浙江 龙泉 323700；2. 杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

描述了浙江凤阳山蔷薇科Rosaceae樱属Cerasus一新种:凤阳山樱桃Cerasusfengyangshanica，并附有墨线图.新种接近黑樱桃C.maximowiczii，但区别在于其叶片边缘具近头状腺体，苞片边缘具棒状腺体，雄蕊30～32枚，芽鳞无毛；比较了两者的花粉形态，结果显示黑樱桃花粉极轴长度明显长于凤阳山樱桃；基于ITS、trnL-trnF和atpB-rbcL 3个基因片段的系统发育分析表明，凤阳山樱桃也明显区别于黑樱桃.

樱属；蔷薇科；新种；花粉形态；系统发育；凤阳山

0 引 言

樱属(樱桃属)CerasusMill.隶属蔷薇科Rosaceae李亚科Prunoideae[1]，全世界约150种，分布于北半球温和地带，亚洲、欧洲和北美洲均有记录[1-2].中国有樱属植物44种，其中5种为引种栽培植物，野生种类以西部和西南部最为丰富[1-2].在中国一些文献中，对李属PrunusL.采用广义的范畴，即包括蔷薇科核果类的6个属:桃属AmygdalusL.、杏属ArmeniacaMill、狭义李属Prunuss.str.、樱属、稠李属PadusMill.和桂樱属LaurocerasusTourn. ex Duh.[3-5].樱属植物中，大多种类的果实成熟时味美，可食用，樱桃在落叶果树中成熟早，因此在中国的栽培历史悠久.观赏的樱花，主要来自山樱花C.serrulata和东京樱花C.yedoensis，培育的园艺品种极多[1].

野生樱属植物的分类也是一个棘手的问题.在花期时，大多植物没有成熟的叶，而叶片边缘锯齿形状、腺体形状、叶片毛被等特征在分类上具有重要意义；在果期时，花部一些特征如萼片是否反折、花柱是否被毛等，以及苞片的一些性状(一些种类苞片在果期脱落)无法观测到.因此，樱属植物在野外的定株观测显得尤为重要，这样能使花期标本和果期标本一一对应，避免在鉴定时“张冠李戴”.

本文采用狭义李属的概念，与《中国植物志》和FloraofChina一致，将樱属从广义的李属分出[1-2]，浙江现知有17种(包括常见栽培种)[6-8].其中以往文献报道的黑樱桃Cerasusmaximowiczii与中国东北和俄罗斯产的有较大区别，主要在叶片边缘具棒状腺体，雄蕊较少[3].因此，通过野外定株观测，在此基础上对浙江产樱属的大部分种类定株采集，结合花粉形态和3个基因片段的系统发育关系分析，确定了产于浙江凤阳山的类群实为一新种，现予以报道.

1 材料与方法

1.1 实验材料

浙江凤阳山存疑的樱属类群采自凤阳山上于桥，花的标本在2015年5月和2016年5月2次采集，同时采集幼嫩的叶片供基因组DNA提取，定株的果期标本于2016年6月采集.用于形态学观察比较的黑樱桃Cerasusmaximowiczii标本保存于中国科学院植物研究所标本馆(俄罗斯:N.Palczevsky3625)和中国科学院沈阳应用生态所标本馆(吉林:J.Y.Li4982).

花粉扫描电镜材料如下:黑樱桃Cerasusmaximowiczii取自标本N.Palczevsky3625，凤阳山的类群取自标本X.F.Jin3502.

用于基因组DNA提取的浙江樱属各个种信息详见表1，表中所有材料的凭证标本均存于杭州师范大学植物标本馆(HTC).黑樱桃的材料来自标本馆中标本上的叶片(俄罗斯:N.Palczevsky3625和吉林:J.Y.Li4982).

表1 实验材料和来源Tab. 1 Materials and resources

1.2 方法

花粉扫描电镜观察时，先在标本上取下雄蕊，用解剖针挑破花药，直接涂抹在粘有双面胶带的样品台上，抽真空后喷金，然后置于Philips XL-30E电镜下观察并拍照.花粉大小测量时，将花粉材料制成临时装片，在光学显微镜下用测微尺测量极轴长(长度)、赤道轴长(宽度)，每个样品随机选择5个视野，每个视野测量3～5粒花粉.

基因组DNA提取材料为野外硅胶干燥的嫩叶，用“天根”(TIANGEN)植物基因组DNA试剂盒提取.扩增的引物为:ITS(5’-AGAAGTCGTAAGGTTTCCGTAGC-3’、5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’)、trnL-trnF(5’-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’、5’-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3’)和atpB-rbcL(5’-ACATCKARTACKGGACCAATAA-3、5’-AACACCAGCTTTRAATCCAA-3’).

PCR反应体系为50 μL:5.0 μL 10× buffer缓冲液, 2.0 μL dNTPs (2 mmol/μL), 每个引物1.0 μL (10 mmol/μL)、4 μL的模板(约20 ng)、0.5 μL Taq酶 (5 U/μL).扩增程序为:94 ℃预变性1 min，94 ℃变性30 s，50～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，40个循环后72 ℃终延伸5 min.PCR反应产物测序由生工(生物)技术有限公司完成，采用双向测序.

1.3 数据处理

花粉测量的数据用SPSS10.0软件进行统计分析.

序列的拼接、比对用ClustalX 1.83软件.排好的序列用PAUP*4.0b10构建最大简约树(maximum parsimony, MP)，最大简约树用启发式搜索(heuristic search)，1 000次随机序列加入，TBR枝长交换.采用1 000次重复取样自展分析(bootstrap)评估系统树的分支的自展支持率.外类群为Prunusmume，其相关序列自NCBI下载.

2 结 果

2.1 花粉形态

实验的2个材料花粉扫描电镜形态见图1.产于凤阳山的樱属植物花粉为长圆球形(赤道面观)，具3沟，极轴长29.95～39.01 μm(34.48 μm±4.53 μm)，赤道轴长20.51～24.49 μm(22.50 μm±1.99 μm)，外壁纹饰为密条纹状，走向与极轴平行，在萌发沟两侧平滑(图1A).黑樱桃的花粉亦为长圆球形(赤道面观)，具3沟，极轴长37.14～44.38 μm(40.76 μm±3.62 μm)，赤道轴长21.44～26.04 μm(23.74 μm±2.30 μm)，外壁纹饰与凤阳山产的一致(图1B).

统计分析后发现，黑樱桃花粉的极轴长与凤阳山的材料有极显著差异(P<0.01)，而赤道轴长2个种差异不显著.

A:凤阳山樱桃；B:黑樱桃. 比例尺=10 μm.图1 凤阳山樱桃和黑樱桃的花粉形态Fig. 1 Pollen micro-morphology of Cerasus fengyangshanica and C. maximowiczii

2.2 聚类分析

本实验共获得樱属12种14个个体的ITS、trnL-trnF和atpB-rbcL 3个基因共42条序列.其中ITS序列长604 bps，变异位点27个(占4.47%)，有效变异位点(信息位点)11个(占1.82%)；trnL-trnF序列长893 bps，变异位点9个(占1.01%)，有效变异位点5个(占0.56%)；atpB-rbcL序列长785 bps，变异位点4个(占0.51%)，有效变异位点3个(占0.38%).3个基因序列拼接后总长度2 282 bps，其中变异位点40个(占1.75%)，有效变异位点19个(占0.83%).

图2显示基于3个基因片段联合分析后的MP树，步长为72，一致性指数(RI)和保留性指数(CI)值分别为0.833和0.863.可见，黑樱桃和凤阳山产的樱桃在不同的支中，能很好区分开.

图2 基于ITS、trnL-trnF和atpB-rbcL序列的12种樱属植物系统发育树Fig. 2 Maximum parsimous consensus tree of 12 Cerasus species based on ITS, trnL-trnF and atpB-rbcL sequences

3 结 论

3.1 花粉形态在李亚科系统分类研究的作用

周丽华等[9]对中国产李亚科10属11种植物的花粉形态进行了系统观测和比较，结果表明Prinselia和Sinoplagiospermum花粉形态和表面纹饰均有区别，可以处理为不同的属.而其对广义Prunus由于选取的种类有限，未进行详细的讨论.但结果显示，桃属、杏属、樱属、稠李属和桂樱属几个种无论是花粉粒大小，还是形状或表面纹饰，均存在很大区别.高博静等[10]对东北杏Prunusmandshurica、毛樱桃P.tomentosa、桃P.persica等种的花粉观察，也得到相似的结果.雷海清[11]对中国产的樱属9种植物花粉形态观察，结果表明樱属的花粉整体一致，但花粉大小、外壁纹饰在种间存在差异，可以在樱属分类时作为参考.

本实验中，黑樱桃与凤阳山产的樱桃花粉均为长圆球形，具3条萌发沟，外壁具细密的条状纹饰，纹饰走向与极轴平行，而在萌发沟附近外壁较平滑.但不同之处在于黑樱桃的花粉显著长于凤阳山产的樱桃.

3.2 基于基因序列的系统发育分析

根据形态特征，尤其是花和果实的特征，蔷薇科传统意义上分为绣线菊亚科Spiraeoideae、蔷薇亚科Rosoideae、苹果亚科Maloideae和李亚科Prunoideae.但系统学家依据分子序列的分析结果不再承认李亚科，而是将其作为绣线菊亚科的一个族[12].徐艳玲等[13]依据ITS序列分析了核果类果树桃、李、梅、杏、樱26个种的系统发育关系，结果显示可以分成樱、桃、李和杏4个分支，这与《中国植物志》的属的处理较一致.而同样依据ITS序列分析花楸属Sorbus的属下系统关系表明，系统发育树与传统的属下分类划分并不吻合[14].

本实验选取了樱属12种14个个体，依据ITS、trnL-trnF和atpB-rbcL 3个基因序列联合分析，所得的MP系统树与《中国植物志》中樱属的传统划分也不太吻合.可见，无论是蔷薇科，还是蔷薇科科内的亚科或属，其系统关系分析需要更加广泛全面的取样，依据更多的序列综合分析才能解决.但是利用分子序列对樱属种类进行鉴定，依然是可以采用的一种科学方法，不仅在本实验中得以反映，以往也有报道[7].

3.3 凤阳山产的樱桃应作为新种处理

综上所述，凤阳山产的樱属植物应作为新种处理，现发表如下:

凤阳山樱桃(图3)

Cerasus fengyangshanica L. X. Ye & X. F. Jin, sp. nov. (Fig. 3)

Species novaC.maximowiczii(Rupr.) Kom. affinis est, sed laminis margine subcapitato-glandulosis, bracteis margine clavato-glandulosis, staminibus 30-32, squamis gemmarum exter glabris differt.

Type: China, Zhejiang (浙江), Longquan (龙泉), Mount. Fengyang (凤阳山), Shangyuqiao (上于桥), alt. 1 500 m, 14 May 2015,X.F.Jin(金孝锋) 3502 (holotype, HTC; isotypes, HTC, ZM).

落叶小乔木；树皮灰褐色.当年生枝密被黄褐色或灰褐色柔毛.冬芽长卵球形，芽鳞无毛.叶片倒卵形、倒卵状椭圆形或倒长卵形，稀卵形，长2.5～8 cm，宽1～3.7 cm，先端短尾尖，稀渐尖，基部宽楔形或近圆形，常具一对黄色腺体，边缘具重锯齿，齿端具近头状腺体，上面干后绿色，除中脉疏被柔毛外其余无毛，下面绿色，中脉和侧脉均疏生柔毛，侧脉7～10对，弧状弯曲；叶柄长5～10 mm，密被黄褐色长柔毛；托叶条形，花时脱落，边缘具腺体.花叶同放，伞房花序具花5～8朵，基部具叶状苞片；总苞片绿色，后脱落，长圆形，长4～5 mm，边缘疏具小腺体；花序轴密被黄褐色柔毛；苞片草质，绿色，宽卵形或倒卵形，长3～4 mm，宽2～3 mm，无毛，边缘具锐锯齿，齿尖具棒状腺体；花梗长6～18 mm，被黄褐色柔毛；萼筒倒圆锥形，长3～4 mm，宽2～3 mm，外面密被柔毛，萼片三角形，反折，比萼筒稍短，先端渐尖，边缘疏具浅齿；花瓣白色，宽卵形或卵圆形，长4～7 mm，宽3～6 mm，先端圆钝，基部具短柄；雄蕊30～32枚，花丝长6～9 mm，不等长，花药宽卵球形；子房卵球形，无毛，长约2.5 mm，花柱长约10 mm，中部以下疏生柔毛，柱头头状.核果成熟时黑色，直径5～6 mm；核表面略有棱纹.花果期5～6月.

A 花枝; B 总苞; C 苞片; D 花纵剖; E 花瓣; F 果枝; G 果实; H 果核.图3 凤阳山樱桃Fig. 3 Cerasus fengyangshanica

Paratypes: Zhejiang (浙江), Longquan (龙泉), Mount. Fengyang (凤阳山), Shangyuqiao (上于桥), alt. 1 500 m, 14 May 2015,X.F.Jin(金孝锋) 3501 (HTC); the same locality, 8 May 2016,Z.H.Chen(陈征海)s.n. (HTC), 5 June 2016,L.X.Ye(叶立新)s.n. (HTC).

致谢 承蒙浙江省森林资源监测中心陈征海教授和谢文远先生、杭州师范大学倪炎栋和蔡鑫同学帮助采集部分实验材料，中国科学院植物研究所于胜祥博士和中国科学院沈阳应用生态所曹伟研究员提供黑樱桃材料，杭州师范大学陈珍慧、滕童莹参加部分实验工作，一并致以诚挚的谢意！

[1] 俞德浚，李朝銮.樱属(蔷薇科)[M].北京:科学出版社，1986:41-89.

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CerasusFengyangshanica(Rosaceae), a New Species from Zhejiang

YE Lixin1, LU Yifei2, WANG Hua2, LIU Shenglong1, JIN Xiaofeng2

(1. Administration of Fengyangshan-Baishanzu National Natural Reserve, Longquan 323700, China; 2. College of Life and Environmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Cerasusfengyangshanica, a new species of Rosaceae from Mount. Fengyang of Longquan, is described with illustrations. This new species is similar toC.maximowiczii, but differs in having leaf blades subcapitate-glandulose at margin, bracts clavate-glandulose at margin, stamens 30～32, and bud scales glabrous. The observations of the pollen grains under SEM (Scanning Electron Microscope) show the pollens ofC.fengyangshanicaare significantly shorter than those ofC.maximowiczii. The phylogenetic analysis of ITS,trnL-trnF andatpB-rbcL genes demonstrates thatC.fengyangshanicadiffers fromC.maximowiczii.

Cerasus; Rosaceae; new species; pollen micro-morphology; phylogeny; Mount. Fengyang

2016-08-04

浙江省野生植物资源调查、建档、编纂及《浙江植物志》(第二版)编著项目(335010-2015-0005).

金孝锋(1978—), 男, 教授, 博士, 主要从事植物分类与系统进化研究. E-mail: docxfjin@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.01.006

Q949

A

1674-232X(2017)01-0019-06