响应面法优化火麻籽蛋白质的提取工艺

刘淑霞，郭永霞，魏国江，韩承伟，杜春玉，潘冬梅，徐海军，关向军，王晓飞，郭梦桥

（1.黑龙江省科学院大庆分院大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学大庆163319；3.大庆市绿色农产品监测中心大庆163319）

响应面法优化火麻籽蛋白质的提取工艺

刘淑霞1，2，郭永霞2，魏国江1*，韩承伟1，杜春玉3，潘冬梅1，徐海军1，关向军1，王晓飞1，郭梦桥1

（1.黑龙江省科学院大庆分院大庆163319；2.黑龙江八一农垦大学大庆163319；3.大庆市绿色农产品监测中心大庆163319）

运用碱提酸沉法从火麻籽中提取粗蛋白质。研究中以提取时间、提取温度、料液比和提取pH值为影响因素，采用单因素试验和响应面试验设计，以火麻籽蛋白质的提取率为指标，确定火麻籽提取工艺参数的最佳组合。结果表明提取时间1.58 h、提取温度49.54℃、液料比20.17：1、提取pH值10.99为蛋白质提取的最佳条件，实际最大提取率为24.47%。火麻籽蛋白质含量较高，具有较大的开发利用价值。

火麻籽；蛋白质；响应面法；提取工艺

火麻（Cannabis sativa L.）又叫工业大麻，火麻籽（Hempseed）是桑科植物火麻的种子。在我国主要分布在黑龙江、甘肃、云南、广西、四川等地。火麻籽营养丰富，主要含有蛋白质、油脂、碳水化合物和可溶性纤维，以及小于0.3%的THC和人体所需的维生素和矿物质，尤其是磷、钾、镁、硫、钙，铁和锌等，同时，铁和锌是人体脂肪酸代谢所必需的辅酶成分，火麻籽中铁和锌的含量和比例最适合人体的需要。火麻籽还含有其他多种天然生物活性成分，是现代纯天然食品中功能性有效成分与生理功能特性较多的功能性食品代表。因此，本试验以我院选育出的经黑龙江省农作物品种审定委员会登记通过，准予推广的“火麻1号”新品种为原料，对其进行脱脂处理后，利用碱溶酸沉法制备火麻籽蛋白，确定其最佳工艺条件，为今后火麻籽的开发利用提供了有利的技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为“火麻1号”麻籽，采自黑龙江省大庆市星火牧场黑龙江省科学院大庆分院试验基地。

1.2 试验方法

1.2.1 火麻籽粗蛋白提取

火麻籽粉碎并脱脂，在一定的温度下，加入氢氧化钠溶液，搅拌提取一定时间，用离心机以3 500 r/min离心20min，去沉淀，取上清液用0.05 mol/L的HCl调节pH值至一定值，4 000 r/min离心20 min分离除去上清液，将得到的蛋白质沉淀加入4倍的蒸馏水，4 000 r/min离心20 min除去上清液，冷冻干燥48 h后称量得火麻蛋白，设三次重复。

1.2.2 蛋白质提取率计算

脱脂火麻籽中总的蛋白质含量按《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5－2010）测定。脱脂后火麻籽中蛋白质的提取率以质量分数w计，数值以百分率（%）表示，按以下公式进行计算：

式中：

m1—冷冻干燥后得到的蛋白质，单位为克（g）；

m0—脱脂火麻籽中总的蛋白质，单位为克（g）。

同时进行三次平行测定，取其算术平均值至小数点后第四位。

1.2.3 火麻籽蛋白提取工艺确定

1.2.3.1 因素试验料液比

液料比：在温度40℃、p H 10、时间1.5 h，液料比分别为30∶1、25∶1、20∶1、15∶1和10∶1（v/m）的条件下进行搅拌提取，离心分离，测定上清液中的蛋白含量；提取温度：在液料比20：1（v/m）、pH 10、时间1.5 h，温度分别为20、30、40、50和60℃条件下进行搅拌提取，离心分离，测定上清液中的蛋白含量；pH值：在液料比20∶1（v/m）、时间1.5 h、温度40℃，pH值分别为8、9、10、11和12条件下进行搅拌提取，离心分离，测定上清液中的蛋白含量；提取时间：液料比20∶1（v/m）、温度40℃、p H 10，时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h条件进行搅拌提取，离心分离，测定上清液中的蛋白含量。

1.2.3.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以火麻籽蛋白质的百分含量为因变量，以提取时间、提取温度、料液比、pH值为自变量，采用四因素五水平二次旋转回归中心组合设计试验，试验设计见表1。

表1 各因素水平编码表Tab.1 Levels and codes of factors

2 仪器设备

中草药粉碎机，精密pH计，精密电子分析天平，电热鼓风干燥箱，离心机，超级恒温水浴箱，数显磁力搅拌器，远红外消化炉，凯氏定氮仪。

3 结果与分析

3.1 不同液料比对火麻籽蛋白提取率的影响

从图1可以看出，随着液料比的增大，蛋白质提取率也随之增大，但液料比超过20∶1以后，蛋白质提取率呈现缓慢增长态势。所以，在实际操作中考虑到工作量的关系，液料比不宜过高。

图1 液料比对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of the ratio of liquid to solid on extraction rate of protein

3.2 不同提取温度对火麻籽粕蛋白提取率的影响

图2 温度对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of protein

从图2中可以看出，温度在20～40℃范围蛋白质提取率增长趋势不明显，40～50℃之间蛋白质提取率增长明显，超过50℃蛋白质提取率明显呈现下降趋势。50℃下蛋白最高提取率23.30%。

3.3 不同p H对火麻籽粕蛋白提取率的影响

图3 pH值对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of pH value on extraction rate of protein

从图3中可以看出，pH值对蛋白质提取率影响明显，pH值8～9时表现蛋白质提取率最低，pH值9～11范围蛋白质提取率增长较快，直到pH值11时呈现提取率最高，最高提取率为23. 50%，之后开始下滑。

图4 提取时间对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of protein

从图4可以看出，提取时间0.5～1.0 h，提取率逐渐增长；从1.0～2.5 h提取率变化不明显，说明温度对蛋白质提取率的影响较小。

3.2 试验模型的建立与显著性检验分析

利用Design expert8.0.6软件对表2中的试验数据进行回归分析，回归模型的方差分析见表3，得到二次回归模型方程为：

表2 响应曲面法优化试验设计及结果Tab.2 Experimental design and results of response surfacemethodology

同时模型的决定系数R2＝0.9644，校正系数R2＝0.9467，说明该模型能解释94.67%响应值的变化，与实际试验拟合良好，试验误差小，证明应用四元二次回归正交旋转组合试验优化提取时间、提取pH值、提取温度和料液比对火麻籽蛋白质提取是可行的。

从表3中可以得出模型的F值为40.63，对应的P＜0.0001，远小于0.01，说明所建立的模型极显著；A、B、C、D的一次项及二次项对应的P＜0.01，对实验结果的影响极显著；交互项AD、BC及CD对应的P＜0.05，对实验结果的影响显著。失拟项的P＝0.9625，大于0.05，说明该模型拟合程度较好，试验误差小，所建立的模型是可行的，可用此模型对火麻籽蛋白质提取工艺条件进行优化。从表3中F值还能得出试验中各因素主次顺序为：D＞B＞C＞A，即提取pH值＞提取温度＞液料比＞提取时间。

表3 回归模型的方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

3.2 响应面分析

采用降维分析法研究其它两因素条件固定在零水平时，有交互作用的两因素对火麻籽蛋白质百分含量的影响，即提取pH值与提取时间、液料比与提取时间和提取温度与液料比的交互作用对火麻籽蛋白质百分含量的影响。图5、图6和图7是Design－Expert8.0.6软件绘出三维曲面及其等高线图，对这些因素中交互项之间的交互效应进行分析。

图5 Y＝f（X1，X4）的响应曲面图及其等高线图Fig.5 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X1，X4）

由图5可以看出，响应曲面坡度相对较大，等高线呈椭圆形，表明提取时间和提取pH值两者交互作用显著。由等高线可知，沿提取pH值方向等高线密集，而提取时间方向等高线相对稀疏，说明提取pH值比提取时间对响应值峰值的影响大。当提取pH值在9～10.5，提取时间在1～1.6 h范围内，两者存在显著的增效作用，响应值随着二者的增加而增大，并达到极值。

图6 Y＝f（X2，X3）的响应曲面图及其等高线图Fig.6 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X2，X3）

由图6可以看出，等高线呈椭圆形，表明提取温度和液料比两者交互作用显著。同时，沿超声功率方向等高线较密集，说明提取温度比料液比对响应值的影响强度更大。当提取温度在30℃～40℃，料液比在15～19范围内，两者存在显著的增效作用，响应值随着二者的增加而增大，并达到极值。而提取温度在40℃～50℃，料液比在19～25范围内，响应值随两个因素的增加而降低。说明模型在试验范围内存在稳定点，且稳定点是最大值。

图7 Y＝f（X3，X4）的响应曲面图及其等高线图Fig.7 Responsive surfaces plot and its contourmap of Y＝f（X3，X4）

由图7可以看出，响应曲面坡度相对较为陡峭，等高线呈椭圆形，表明料液比和提取pH值两者交互作用显著。同时，提取pH值对提取率的响应曲面比料液比对其的响应曲面更为陡峭，说明提取pH值比料液比对响应值的影响强度更大。当提取pH 9～10.5，料液比在10～23范围内，响应值随着二者的增加而增大。而提取pH值在10.5～11，料液比在23～25范围内，响应值随两个因素的增加而降低。说明模型在试验范围内存在稳定点，且稳定点是最大值。

3.3 响应面优化结果与验证试验

通过优化结果，选出“火麻1号”麻籽蛋白质制备的最佳工艺参数，并得出麻籽蛋白质的最大百分含量见表4。

表4 “火麻1号”麻籽蛋白质制备的最佳工艺参数优化结果及验证表Tab.4 Optimum process parameters optimization for hemp protein preparation and verification experiment results

按上述优化试验条件并结合实际情况进行3次验证试验，得“火麻1号”麻籽蛋白质提取量平均值为24.47%，与模型预测值的相对误差为0.54%，说明重复性良好，试验优化结果可行。

4 结论

采用碱提酸沉法和响应面试验确定了“火麻1号”麻籽中蛋白质提取的最佳条件：提取时间1. 58 h、提取温度49.54℃、料液比1∶20.17、提取pH值10.99，最大实际提取率为24.47%。“火麻1号”麻籽中蛋白质含量较高，具有较大的开发利用价值，这对于我院培育出的火麻新品种的推广、开发和利用具有重要的理论基础和技术支撑。

［1］李白玉，郑兵福，蒋立文，等.四棱豆蛋白质提取工艺研究［J］.食品与机械，2006，26（2）：126－128.

［2］李红艳，邓泽元，单斌，等.决明子蛋白质提取工艺研究及其体外消化率的测定［J］.食品科技，2008（5）：73－74.

［3］黄来珍，谢伟彬，邵海艳，等.大豆饼粕分离蛋白的制取工艺研究［J］.食品研究与开发，2011，32（9）：53－56.

［4］赵海阳，林年丰，包海鹰.黄花草木樨种子蛋白质含量测定及其提取工艺研究［J］.长春中医药大学学报，2013，29（3）：534－536.

［5］张维.工业大麻籽蛋白的制备与功能特性研究［D］.江南大学，2008.

［6］林金莺，曾庆孝，安琪，等.超声波辅助碱法提取火麻仁蛋白的研究［J］.粮油加工，2009，2：62－64.

［7］董欣炜.紫花苜蓿叶蛋白提取工艺研究［D］.西南大学，2008.

［8］陆晨，邹雨虹，张士康，等.响应面法优化超声辅助提取茶渣蛋白质的工艺条件［J］.食品与生物技术学，2012，31（3）：319－325.

Optim ization of Extraction Technology of Hemp Protein by Response Surface M ethod

LIU Shuxia1，2，GUO Yongxia2，WEIGuojiang1*，HAN Chengwei1，DU Chunyu3，PAN Dongmei1，XU Haijun1，GUAN Xiangjun1，WANG Xiaofei1，GUO Mengqiao1
（1.Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；3.Daqing Green Agricultural Products Monitoring Center，Daqing 163319，Heilongjiang，China；）

The traditionalmethod of alkaliextraction and acid precipitation was used to gain the protein of“Hemp seed No.1”in this paper.Four factors were taken into account，including extracting time，emperature，ratio of liquid to solid and pH value.Meanwhile the single factor tests and response surface experimentwere designed to get the optimal combination for the max extraction ratio of protein. The result showed that under the optimized condition of extracting time 1.58 h，extracting temperature at 49.54℃，pH 10.99，ratio of liquid to solid 20.17：1，the protein yield could reach 25.01%.Italso indicated that“Hemp seed No.1”had high content of protein，which would be of great value for futher development and utilization.

hemp seed；protein；response surfacemethod；extraction technology

R284.2

：A

1671－3532（2017）01－0037－07

2016－09－05

基金来源：黑龙江省院所基本应用技术研究“盐渍化土壤汉麻高产、优质、高效栽培技术模式研究与示范”

刘淑霞（1982－），女，副研究员，作物栽培学与耕作学研究。E－mail：258426121＠qq.com

魏国江（1963－），男，高级农艺师，作物遗传育种与开发利用。E－mail：weiguojiang2008＠163.com