脐血干细胞移植联合电针治疗对损伤脊髓脑源性神经营养因子表达的影响

梁希港　陈方民　杨成

摘要：目的 观察脐血干细胞（umbilical cord blood stem cells）移植联合督脉电针治疗对脊髓全横断损伤（spinal cord injury，SCI）大鼠的脑源性神经营养因子表达的影响。方法 建立SD大鼠T10脊髓节段完全横断模型，随机分为正常组、损伤模型组、督脉电针治疗组、脐血干细胞移植组、督脉电针治疗联合脐血干细胞移植组（分别简称正常组、模型组、电针组、脐血组、联合组），每组再分为3个时间段7 d、14 d、28 d，每组共大鼠18只。分别于7 d、14 d、28 d分离各组大鼠的脊髓组织，应用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot技术定位、定量检测各组组织中脑源性神经营养因子BDNF的表达变化。结果 电针治疗组、脐血移植组和联合组脑源性神经营养因子的表达都高于损伤模型组，脐血干细胞移植联合电针治疗组表达量最高。结论 结果显示脐血干细胞移植和电针治疗具有协同作用，能显著提高脑源性神经营养因子的表达，对脊髓损伤的功能恢复有促进作用。

关键词：脊髓损伤；脐血干细胞；电针；脑源性神经营养因子

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种严重的神经系统创伤性疾病，临床康复治疗效果仍不理想。中枢神经系统损伤后，神经营养素家族的表达发生改变，这些改变与神经系统的可塑性有重要关系[1]。成年哺乳动物脊髓具有可塑性，且针刺可促进脊髓可塑性[2-6]。研究证实，督脉电针可以改善损伤局部组织的血液微循环，促进脑脊液流动，减轻SCI部位的水肿、血肿的压迫及粘连，抑制脊髓继发性损伤，同时督脉电针治疗可以促进SCI脊髓神经轴突的再生[6]。在过去的几年中，干细胞成为再生医学的研究焦点。胚胎干细胞，尽管能够分化成所有三个胚细胞谱系层，但是它的使用受到伦理问题的限制[7]。自从1974年Kandtzon等发现人脐血中存在造血干细胞后，国内外学者对脐血干细胞的生物学、免疫学特性及临床应用进行了广泛的研究[8]，证实脐血可以作为一种新的干细胞来源治疗恶性血液病、退行性疾病及修复神经损伤等。目前，人脐血干细胞（human umbilical cord blood stem cell，hUCBSC）移植治疗脊髓损伤是脊髓修复领域的研究热点，在动物实验中已取得满意效果，并有初步的临床研究。本研究將人脐血干细胞移植和督脉电针治疗联合应用，观察对脊髓损伤后BDNF表达的影响，以期为电针治疗联合脐血干细胞移植临床应用治疗脊髓损伤提供理论和实验依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 实验动物选择与分组：90只成年雌性SD大鼠（SPF级），体重220～260 g，购自烟台绿叶制药有限公司。随机分为5组，正常组、损伤对照（CT）组、督脉电针治疗（EA）组、脐血干细胞移植（UCS）组、督脉电针治疗联合脐血干细胞移植（UCS+EA）组，每组18只。

1.2方法

1.2.1样本获取 ①造模后7，14，28 d各时间点每组随机取3只大鼠，40 g/L多聚甲醛心脏灌注固定，取损伤处头端长约1 cm脊髓组织，中性甲醛溶液后固定，石蜡包埋，切片。②造模后7，14，28 d各时间点每组随机取3只大鼠，脊髓新鲜取材，置-80℃冰箱冷存，以备提取蛋白及mRNA。

1.2.2免疫荧光组织化学观察 取各组标本石蜡切片，厚4 μm，常规脱腊至水；抗原修复；山羊血清封闭；滴加兔抗大鼠BDNF单克隆抗体（1∶200，abcam公司），4℃过夜；Cy3标记山羊抗兔IgG（1∶100，北京中杉金桥技术有限公司），37℃、30 min；DAPI复染；封片。在激光共聚焦显微镜下观察、照相。图像经LEICA QWin图像处理与分析系统处理，统计阳性表达面积（m2）、平均灰度值，分析BDNF的阳性表达变化。

1.2.3 RT-PCR检测 采用Trizol试剂盒（Invitrogen公司），根据说明书操作，提取各组脊髓织中的总RNA，溶于20 μL DEPC-H2O，-80℃冰箱冷存。

BDNF引物序列：上游：5'-ATAGCAGGGCAGTTGGACA-3'；下游：5'-CACCTTGGCGATTACAGAAG-3'；GAPDH序列：上游：5'-CGTGCCGCTGGAGAAACCTG-3'；下游：5'-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'。

加样完成后离心，放入荧光定量PCR仪（ABI Prism？7300型，Corbett research公司，澳大利亚），按以下条件进行Real-time PCR反应：①步骤一：变性，重复1次，95℃，30 s；②步骤二：PCR反应，重复40次，95℃，5 s→60℃，34 s。

每个待测样品cDNA设置3个重复，对得到的3个Ct值取平均值，用2-△△Ct[8，10]法进行计算最后与GAPDH进行校正后统计。

1.2.4 Western Blot检测 抽提28 d各组标本总蛋白，采用BCA方法测定BDNF蛋白含量。依次经5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶、8%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，转移蛋白至硝酸纤维素膜；5%脱脂奶粉封闭2 h；孵育袋内根据需要加入兔抗大鼠抗体BDNF IgG，4℃孵育过夜；TBS-T洗膜；加入山羊抗兔HRP IgG，37℃，孵育1 h，TBS-T洗膜。胶片曝光、经显影、定影处理后观察结果，扫描，采用Image J软件分析。

1.3统计学处理 数据以（x±s）表示，用SPSS统计学软件处理，两组间差异比较选用t检验。

2 结果

2.1免疫荧光检测大鼠脊髓损伤后不同时间点灰质内BDNF的表达变化 免疫荧光显示BDNF阳性细胞染色呈红色，轮廓清晰，主要为脊髓的星形胶质细胞。建模后28 d，与对照组大鼠相比，PD大鼠脊髓组织中BDNF荧光强度分别增强了62.7%、49.1%和145%（P<0.05），见图1。检测结果发现：联合组的BDNF表达量最高。

图1 免疫荧光结果

2.2 RT-PCR检测大鼠脊髓损伤后不同时间点BDNF mRNA的相对表达量 Real-time PCR结果显示：BDNF在脊髓损伤大鼠脊髓组织中7 d组表达分别为（9.8±1.0）、（8.0±1.5）、（22.2±3.9），均较模型对照组（2.4±0.8）明显升高（Fig.2A，B），差异有统计学意义（P<0.05）。14 d组表达分别为（3.8±0.7）、（7.9.0±1.3）、（13.2±1.6），均较模型对照组（0.4±0.05）明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；28 d组表达分别为（3.4±0.7）、（2.2±0.4）、（5.2±1.0），均较模型对照组（0.4±0.07）明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Real-time PCR检测结果发现：BDNFmRNA在模型组表达较低，在治疗组的表达明显升高。损伤7 d后明显升高，并达到高峰，14 d和28 d表达量有所下降，但明显高于模型组。

2.3大鼠脊髓损伤后28dBDNF蛋白的表达变化 Western-Blot结果显示：与模型组相比，建模后28 d，SCI大鼠脊髓组织BDNF的蛋白表达量分别增加了41.3%、3.5%和59.8%（P<0.05），差异有统计学意义，见图2。

图2 脑源性神经营养因子在28 d组大鼠中蛋白表达水平

3 讨论

脊髓损伤一直是医学界面对的一大难题，它涉及损伤即刻的原发性损伤和后续的继发性损伤。原发性损伤是直接损伤，多为不可逆的创伤性损伤；继发性损伤为创伤后的病理生理过程，其损伤机制十分复杂[9]。

干细胞的研究是一个快速发展的领域，人类脐血干细胞已经证明在许多疾病模型中有肯定效果[10]。脐血干细胞有来源广泛、低的免疫性、容易获得等优点。最主要的是他可以分化为不同的细胞，例如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、、内皮细胞、神经细胞等。然而如何能够有效的将脐血干细胞转化为脊髓损伤后的细胞是一个具有挑战性的技术难题。脊髓损伤治疗目标有两个：挽救受损神经元的继发性损伤和死亡；促进神经元轴突的再生。脊髓继发性损伤是在原发性损伤的基础上，损伤局部发生的复杂的病理生理改变，包括缺血缺氧、兴奋性氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶释放、中枢神经系统小胶质细胞活化以及周围巨噬细胞浸润导致的炎性反应等。研究发现，SCI后损伤脊髓局部BDNF免疫反应阳性，星形胶质细胞和小胶质细胞/巨噬细胞数量显著增加，SCI后1 w，大多数少突胶质细胞呈BDNF免疫反应阳性，提示BDNF与SCI后脊髓修复关系密切[11-12]。

NTFs是轴突再生微环境中的一组重要因子，除对中枢神经系统有营养作用外，还可能参与中枢神经系统损伤后的修复，如生长相关蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、BDNF、神经营养素等，其中BDNF是目前研究最为广泛和深入的NTFs之一。研究表明，BDNF可诱导神经干细胞（neural stem cells，NSCs）增殖、分化，调节自由基代谢，减少自由基积聚，保护神经元免受自由基的攻击。本试验中将脐血干细胞移植和电针治疗结合起来，通过对检测脑源性神经营养因子（BDNF）的表达量来评估两者在脊髓损伤过程中的效果。从动物实验的结果中可以看出，单纯的脐血干细胞和电针治疗都对脊髓损伤有一定的治疗效果，而两者的联合呈现出明显的优势，提示在治疗脊髓损伤的过程中联合运用多种治疗手段可起到很好的协同作用。有关脑源性神经营养因子（BDNF）在神经细胞增殖分化的过程中的作用，对移植干细胞的分化方向等尚需进一步的研究。

参考文献：

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編辑/罗茗柯