人肌母细胞瘤体注射对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的治疗观察

毋蓓蓓，李巧云，李晓丽

(郑州大学第五附属医院，郑州450052)

人肌母细胞瘤体注射对人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的治疗观察

毋蓓蓓，李巧云，李晓丽

(郑州大学第五附属医院，郑州450052)

目的 观察人肌母细胞瘤体注射治疗人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的效果，并与顺铂进行比较。方法 裸鼠45只，皮下注射HeLa细胞制作宫颈癌细胞移植瘤，随机分为人肌母细胞组、顺铂组、生理盐水组各15只，分别采取人肌母细胞瘤体注射、顺铂腹腔注射、生理盐水瘤体注射，用药后连续观察4周。于用药前后观察裸鼠一般情况，测算裸鼠体质量及肿瘤体积；采用HE染色观察各组肿瘤组织形态及细胞形态；分别采用免疫组化法、Western blotting法检测肿瘤组织中的p53蛋白。结果 人肌母细胞组裸鼠用药后体质量较治疗前增高，肿瘤体积较用药前缩小，且用药后肿瘤体积小于其余两组(P均<0.05)。人肌母细胞组裸鼠用药后的反应性、精神、饮食状况均优于其余两组。病理检查示生理盐水组细胞异型性明显、肿瘤细胞体积大、细胞核增多；人肌母细胞组可见大量凋亡坏死的肿瘤细胞，大量细胞固缩、细胞核碎裂，肿瘤组织纤维化明显；顺铂组肿瘤细胞固缩、细胞核裂解不明显，肿瘤组织纤维化程度不显著。人肌母细胞组、顺铂组、生理盐水组肿瘤组织中p53蛋白阳性表达率分别为20.0%、33.3%、60.0%，p53蛋白相对表达量分别为0.321±0.054、0.379±0.067、0.534±0.064，三组相比，P均<0.05。结论 人肌母细胞瘤体注射可减小人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤的体积，促使肿瘤细胞凋亡(机制可能与下调p53蛋白表达有关)，抑瘤效果优于顺铂。

宫颈癌；人肌母细胞；顺铂；动物实验；p53

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一[1]，我国宫颈癌的发病率及病死率也居高不下[2]。目前宫颈癌的治疗方案仍是以手术为主，辅以放化疗[3,4]。然而，放化疗除能有效杀死肿瘤细胞外，对正常组织细胞的破坏力也极大，不良反应多。人肌母细胞基因疗法(HMGT)作为一种前研治疗手段逐渐受到学者重视，在治疗器官退化所致疾病方面已初有成效[5]。Parlakian等[6]研究证明人肌母细胞可以抑制黑色素瘤细胞生长。2015年12月～2016年3月，我们制作了人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型，给予人肌母细胞瘤体注射治疗，观察人肌母细胞对宫颈癌的治疗作用，并与传统抗肿瘤药物顺铂[7,8]进行对比，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 细胞株：宫颈癌HeLa细胞株(武汉大学细胞库)、人肌母细胞(武汉罗盖人肌母细胞医学研究院，取自健康成年男性股四头肌)。实验动物：雌性BALB/c裸鼠45只(北京维通利华有限公司)，SPF级动物房饲养，水和饲料经高压灭菌处理，温度22 ℃、湿度55%、12 h明暗交替。实验试剂与器械：细胞培养用DMEM培养基、胎牛血清、胰酶等(Gibco公司)，顺氯氨铂(北京中杉金桥有限公司)，GAPDH(康为世纪公司)，p53抗体(碧云天公司)。

1.2 人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型的制作 取对数生长期的HeLa细胞，胰酶消化，2 min后停止消化，离心，PBS洗涤，制成1×108/mL的宫颈癌细胞悬液。用1 mL一次性注射器抽取悬液，依次皮下注射于裸鼠左侧腋下(0.2 mL)，隔日用游标卡尺测量瘤体的长径(a)和短径(b)。至肿瘤直径增长至3～5 mm，裸鼠对外界反应可，饮食可，体质量无明显下降，视为建模成功。

1.3 人肌母细胞注射方法 将建模成功的裸鼠随机分为人肌母细胞组、顺铂组和生理盐水组，每组15只。人肌母细胞组裸鼠瘤体内注射人肌母细胞悬液(多点注射，0.2 mL，1×107个细胞)，顺铂组腹腔注射顺铂(3 mg/kg)，生理盐水组瘤体注射生理盐水0.2 mL，用药后连续观察4周。

1.4 裸鼠体质量、肿瘤体积测算及一般情况观察 每天记录裸鼠体质量，观察裸鼠精神状况、肿瘤质地，隔日测量肿瘤长短径、计算肿瘤体积，4周后处死裸鼠并取出肿瘤组织。

1.5 肿瘤组织病理观察 将各组肿瘤组织在多聚甲醛溶液固定48 h后，常规石蜡切片，HE染色，每只裸鼠取1张瘤体切片，随机选择3个视野，选视野中心观察，拍摄肿瘤细胞变性坏死明显处。

1.6 肿瘤组织中p53蛋白[5,9]检测 ①定性检测：取肿瘤组织做石蜡切片，根据免疫组化试剂盒说明书操作，以细胞核中出现棕色或棕褐色颗粒为p53蛋白阳性细胞，每份随机观察5个高倍视野(400×)，根据阳性细胞百分比和染色强度判定结果：阳性细胞百分比≤5%计0分，>5%～25%计1分，>25%～50%计2分，>50%～75%计3分，>75%计4分；染色呈黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分；两项得分相乘，0为阴性(-)，1～4为弱阳性(+)，5～8中度阳性(++)，9以上为强阳性(+++)，+～+++判定为p53蛋白表达阳性。②定量检测：提取组织蛋白，将PBS清洗3遍后的细胞置于培养皿上，加细胞裂解缓冲液，冰上孵育10 min，使用细胞刮刀刮2 min，置于Eppendorf管中，先后煮沸、离心各10 min，取上清液，再按照蛋白提取试剂盒说明提取蛋白；进行SDS-PAGE电泳后，用湿转法转膜，牛奶封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育1 h，压片、暗室显影，用Image J软件分析计算p53蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组裸鼠用药前后体质量、肿瘤体积及一般情况 各组裸鼠无死亡。人肌母细胞组、顺铂组和生理盐水组用药前体质量分别为(16.05±0.18)、(16.09±0.15)、(16.08±0.13)g，用药后分别为(16.35±0.26)、(16.09±0.18)、(15.72±0.19)g；人肌母细胞组裸鼠用药后体质量较治疗前增高，生理盐水组用药后体质量降低(P均<0.05)。人肌母细胞组、顺铂组和生理盐水组用药前肿瘤体积分别为(36.71±0.52)、(36.77±0.68)、(36.53±0.85)mm3，用药后分别为(20.14±1.88)、(55.42±3.35)、(94.97±4.68)mm3；人肌母细胞组用药后肿瘤体积较用药前缩小，生理盐水组肿瘤体积较用药前增大，且人肌母细胞组用药后肿瘤体积小于其余两组(P均<0.05)。人肌母细胞组用药后对外界刺激反应灵敏，精神可，无明显饮食改变；顺铂组对外界刺激反应一般，精神欠佳，饮食减少；生理盐水组对外界刺激反应迟钝，精神差，饮食明显减少。

2.2 各组用药后肿瘤组织病理变化 生理盐水组可见分化程度较高的肿瘤细胞，细胞异型性明显，视野中可见肿瘤细胞体积大、细胞核增多；人肌母细胞组可见大量凋亡坏死的肿瘤细胞，大量细胞固缩、细胞核碎裂，肿瘤组织纤维化明显，并有大量的坏死组织和炎症细胞；顺铂组肿瘤细胞固缩、细胞核裂解不明显，肿瘤组织纤维化程度不显著，可见部分组织坏死、炎症细胞浸润。见图1。

注：A为生理盐水组；B为人肌母细胞组；C为顺铂组。

图1 各组用药后肿瘤组织病理变化(HE染色，400×)

2.3 各组肿瘤组织中p53蛋白表达比较 人肌母细胞组、顺铂组、生理盐水组肿瘤组织中p53蛋白阳性表达率分别为20.0%、33.3%、60.0%(见图2)，p53蛋白相对表达量分别为0.321±0.054、0.379±0.067、0.534±0.064，三组相比，P均<0.05。

注：A为生理盐水组；B为人肌母细胞组；C为顺铂组。

图2 各组肿瘤组织中p53蛋白表达情况(HE染色，400×)

3 讨论

宫颈癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，也是对女性健康危害最大的恶性肿瘤。研究[10]表明宫颈癌全球每年新发病例约50万，其中80%的患者来自发展中国家。在发病率不断升高的同时，宫颈癌的传统治疗手段(如手术辅以放化疗)疗效有限，在达到一定治疗剂量时局部控制率难以提高，并发症却不断增加[4]。传统化疗药物顺铂可阻止G1期肿瘤细胞的DNA复制，对宫颈癌有一定治疗效果，但患者会产生难以耐受的消化道症状及骨髓抑制等[11]，且肿瘤细胞耐药率较高[12]。我们在本次实验中也观察到，顺铂对裸鼠消化系统存在毒性作用，顺铂组裸鼠在反应性、精神、饮食方面的表现并不理想。寻找一种并发症少、疗效好的治疗方案对于控制宫颈癌病情、改善患者生活质量有重要意义。

成肌细胞是一种胞质含有肌组织的前体细胞，在胚胎发育过程中由间充质细胞转化而来，其最终分化为成熟的肌细胞。炎症状态下，人肌母细胞被激活，调节细胞增殖与分化[13]。1990年国外学者[14]首次发现人肌母细胞可修复受损基因、补充杜氏肌营养不良症患者体内的抗肌萎缩蛋白。随后有学者[15]将其应用于缺血性心肌病的治疗，显示出较好的疗效和较高的安全性。近年来研究[16]显示，对前列腺癌小鼠模型注射人肌母细胞能够抑制实体肿瘤的生长及转移。我们制作了人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤模型，给予人肌母细胞瘤体注射，结果显示人肌母细胞组裸鼠一般情况较好，裸鼠体质量增加，肿瘤体积缩小，提示人肌母细胞对宫颈癌有一定的治疗作用，且不良反应小于顺铂。进一步病理观察显示，人肌母细胞组肿瘤细胞大量凋亡，肿瘤组织纤维化明显，表明人肌母细胞注射可促使宫颈癌细胞发生凋亡，推测机制与人肌母细胞通过旁分泌炎症因子参与并导致细胞凋亡有关[10]。

p53基因是最常见的抑癌基因[17]，其编码产物是核转录因子，当DNA损伤或癌基因突变时，p53接到应激信号，细胞内p53蛋白水平升高[18,19]。p53基因在所有肿瘤细胞中均可能发生突变[20]。本研究观察了各组肿瘤组织中p53蛋白的表达变化，结果显示，人肌母细胞组p53蛋白阳性表达率和相对表达量均低于其余两组，推测人肌母细胞对宫颈癌的治疗作用还可能与调控p53蛋白表达有关。

结合上述实验结果，我们认为，人肌母细胞瘤体注射治疗人宫颈癌细胞裸鼠移植瘤在缩小肿瘤体积、破坏肿瘤细胞、促进肿瘤细胞凋亡方面的效果较顺铂明显；而且，与传统化疗药物顺铂相比，人肌母细胞在治疗过程中无消化道反应、骨髓抑制等难以耐受的不良反应，对体质量、饮食情况、精神状态的影响较小。如将人肌母细胞用于宫颈癌治疗的临床试验，可能有助于更好地控制病情、改善患者生存质量及治疗依从性。然而，本实验纳入样本量偏少，仍需进行大样本动物实验验证有效性和可行性，且治疗的最佳时机、注射方式、注射剂量、追加时机、疗程设定等也需进一步探索。

[1] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality Sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012[J]. Int J Cancer J Int Cancer, 2015,136(5):359-386.

[2] Du K, Gong HY, Gong ZM. Influence of serum VEGF levels on therapeutic outcome and diagnosis /prognostic value in patients with cervical cancer[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2014,15(20):8793-8796.

[3] Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al. Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008[J]. Int J Cancer, 2010,7(12):2893-2917.

[4] Green JA, Kirwan JM, Tierney JF, et al. Survival and recurrence after concomitant chemotherapy and radiotherapy for cancer of the uterine cervix: a systematic review and meta-analysis[J]. Lancet, 2001,358(9284):781-786.

[5] Liu J, Zhang C, Feng Z. Tumor suppressor p53 and its gain-of-function mutants in cancer[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2014,46(3):170-179.

[6] Parlakian A, Gomaa I, Solly S, et al. Skeletal muscle phenotypically converts and selectively inhibits metastatic cells in mice[J]. PLoS One, 2010,5(2):e9299.

[7] 曹静玲.紫杉醇联合顺铂新辅助化疗对宫颈癌组织OPN和VEGF表达的影响[J].山东医药,2015,55(25):71-72.

[8] 陈雨,周颖,张雪芬.奈达铂或顺铂联合紫杉醇应用于宫颈癌辅助化疗的比较分析[J].实用妇产科杂志,2015,31(11):862-865.

[9] Kastan MB, Berkovich E. p53: a two-faced cancer gene[J]. Nat Cell Biol, 2007,9(5):489-491.

[10] Valdespino VM, Valdespino VE. Cervical cancer screening: State of the art[J]. Curr Opin Obstet Gynecol, 2006,18(1):35-40.

[11] Yu W, Jin C, Lou X, et al. Global analysis of DNA methyla-tion by Methyl-Capture sequencing reveals epigenetic control of cisplatin resistance in ovarian cancer cell[J]. PLoS One, 2011,6(12):29450.

[12] Muggia F. Platinum compounds 30 years after the introduction of cisplatin: implications for the treatment of ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol, 2009,112(1):275-281.

[13] Gopinath SD, Rando TA. Stem cell review series: aging of the skeletal muscle stem cell niche[J]. Aging Cell, 2008,7(4):590-598.

[14] Kehat MG, Kenyagin-Karsenti D, Sinr M, et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cadiomyocytes[J]. J Clin Invest, 2001,108(3):407-414.

[15] Koh GY, Klug MG, Soonpaa MH, et al. Differentiation and long-term survival of C2Cl2 myoblast grafts in heart[J]. J Clin Invest, 1993,92(3):1548-1554.

[16] Stolting MNL, Ferrari S, Handschin C, et al. Myoblasts inhibit prostate cancer growth by paracrine secretion of tumor necrosis factor-alpha [J]. J Urol, 2013,189(5):1952-1959.

[17] Lee WC, Lee SY, Koo YJ, et al. Establishment of a Korea HPV cohort study[J].J Gynecol Oncol, 2013,24(1):59-65.

[18] Livesey KM, Kang R, Vernon P, et al. p53/HMGB1 complexes regulate autophagy and apoptosis[J]. Cancer Res, 2012,72(8):1996-2005.

[19] Dong XX, Wang YR, Qin S, et al. p53 Mediates autophagy activation and mitochondria dysfunction in kainic acid-induced excitotoxicity in primary striatal neurons[J]. Neuroscience, 2012,207(5):52-64.

[20] 劳小斌,刘晓强,邱春嫦.宫颈癌患者人乳头状瘤病毒16型感染与P53基因表达及临床意义[J].中华医院感染学杂志,2013,23(24):5918-5920.

河南省科技攻关计划普通项目(152102310074)。

李巧云(E-mail: qiaoYunli11@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.010

R737.33

A

1002-266X(2017)03-0036-03

2016-08-18)