ARHI对5-FU诱导胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响

唐海灵， 庄 坤， 左利平， 张 欣， 杨振威， 韩 坤

(西安市中心医院消化内科，西安 710003；*通讯作者，E-mail：hankun411@163.com)

ARHI对5-FU诱导胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响

唐海灵， 庄 坤， 左利平， 张 欣， 杨振威， 韩 坤*

(西安市中心医院消化内科，西安 710003；*通讯作者，E-mail：hankun411@163.com)

目的 探讨ARHI对5-FU诱导胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响。 方法 以稳定转染pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重组质粒的BGC-823胃癌细胞系为模型，采用5-氟尿嘧啶(5-FU)刺激细胞24 h，通过流式细胞术检测细胞周期和凋亡的改变，利用Western blot检测cyclin D1、Bax、Bcl-2及活化caspase-3蛋白的表达水平。 结果 ARHI与5-FU都能够导致BGC-823细胞发生G1期阻滞，G1期比例分别增加至61.64%±4.56%(P<0.05)和65.71%±4.89%(P<0.01)，二者联合作用效果更明显，G1期比例增加至81.14%±5.63%(P<0.01)；ARHI与5-FU引起的G1期阻滞与cyclin D1的表达水平降低相关；ARHI对BGC-823细胞凋亡没有影响，5-FU可导致细胞凋亡，凋亡率为7.22%±1.55%(P<0.01)，而二者联合作用导致更显著的细胞凋亡，凋亡率达到17.34%±2.81%(P<0.01)；5-FU单独或与ARHI联合促使Bax/Bcl-2比值增高、caspase-3的活化增强。 结论 ARHI能够增强5-FU诱导的胃癌细胞周期阻滞和凋亡。

胃癌； 抑癌基因； ARHI； 5-氟尿嘧啶； 细胞周期； 细胞凋亡

近几十年来胃癌发病率不断下降，但胃癌仍然是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，居于癌性死因的第3位。胃癌患者男女比例为2∶1，中国、日本、韩国等东北亚国家是胃癌高发国家，其男性发病率可达69/10万，而欧美等国家的胃癌发病率较低。虽然胃癌的临床治疗方法不断改进，但多数胃癌患者确诊时已是晚期，因此，其5年生存率不足30%[1]。

人ARHI(aplysia ras homolog Ⅰ)基因定位于染色体1p31，编码一种小GTP结合蛋白，属于Ras超家族成员。虽然与原癌基因Ras具有54%-59%的同源性，但ARHI却属于肿瘤抑制基因，是Ras超家族中发现的第一个抑癌基因。ARHI在多种肿瘤组织和细胞中低表达，而过表达ARHI对多种肿瘤细胞具有抑制效应[2]。本课题组前期发现ARHI在胃癌组织及细胞系中表达降低，而过表达ARHI能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[3]。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)是胃癌化疗的基本药物，与其他化疗药物类似，在临床应用过程中同样面临着耐药性问题。本研究拟检测过表达ARHI对胃癌细胞5-FU化疗敏感性的影响，并揭示其相关的分子机制。

1 材料和方法

1.1 主要仪器

CO2细胞培养箱(SANYO，日本)；小型台式高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；Infinite 200 Pro多功能酶标仪(Tecan，瑞士)；蛋白电泳仪(Bio-Rad，美国)；FACSCalibur流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)；FluorChem FC2凝胶成像分析系统(Alpha Innotech，美国)。

1.2 主要试剂

DMEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；细胞培养用青霉素-链霉素、胰酶细胞消化液、Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；抗cyclin D1、Bax、Bcl-2、活化caspase-3、β-actin抗体(Cell Signaling Technology，美国)；BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒(Pierce，美国)。

1.3 细胞培养

稳定转染pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重组质粒载体的BGC-823胃癌细胞系由本室保存。细胞接种于25 cm2培养瓶中，加入约5 ml DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素)，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每2-3 d胰酶消化传代1次。

1.4 稳定细胞系的建立

本课题组前期已经建立了稳定表达pIRES2-EGFP或pIRES2-EGFP-ARHI重组质粒载体的BGC-823胃癌细胞系[3]。简要过程为：将pIRES2-EGFP对照载体及构建好的pIRES2-EGFP-ARHI重组质粒载体转染BGC-823细胞，采用遗传霉素(G418，400 μg/ml)筛选4周，通过Western blot鉴定ARHI的表达，获得稳定转染细胞系。

1.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡

检测细胞凋亡按试剂盒说明书进行，简要过程为：采用10 μmol/L的5-FU刺激BGC-823细胞24 h，然后收集细胞，取1×105个细胞，依次加入Annexin Ⅴ-FITC结合液、Annexin Ⅴ-FITC、碘化丙啶(PI)染色液，室温避光孵育20 min，然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。检测细胞周期的简要过程为：将收集的细胞中加入预冷的70%乙醇固定过夜，加入PI染色液，37 ℃避光孵育30 min，然后通过流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 Western blot检测蛋白表达

采用10 μmol/L的5-FU刺激BGC-823细胞24 h，然后收集细胞，加入适量RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白，采用BCA法进行蛋白定量后，加入样品缓冲液煮沸5 min。取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE、转膜，然后用5%脱脂奶粉封闭NC膜，依次加入一抗、二抗，最后采用ECL化学发光试剂盒显色并成像。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 ARHI对5-FU诱导的细胞周期的影响

以稳定转染了pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-ARHI质粒载体的BGC-823细胞系为模型，5-FU处理细胞后，通过流式细胞术检测细胞周期的变化。结果表明：pIRES2-EGFP组细胞G1期比例为55.10%±4.37%；pIRES2-EGFP-ARHI组细胞发生G1期阻滞，G1期比例增加为61.64%±4.56%(P<0.05)；5-FU刺激后同样引起细胞发生G1期阻滞，G1期比例增加为65.71%±4.89%(P<0.01)；而ARHI与5-FU联合作用导致更为显著的G1期阻滞，G1期比例增加为81.14%±5.63%(P<0.01)。随着G1期比例增高，相应的G2期和S期的比例下降(见图1)。

2.2 ARHI与5-FU对cyclin D1蛋白表达的影响

为检测ARHI和5-FU引起BGC-823细胞周期阻滞的分子机制，5-FU处理BGC-823细胞后，通过Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1的表达，结果表明：ARHI与5-FU都对cyclin D1的表达具有一定的抑制作用，5-FU的抑制效果较ARHI明显，而二者联合作用进一步显著抑制了cyclin D1的表达(见图2)。

与pIRES2-EGFP组比较，*P<0.05，**P<0.01图1 ARHI与5-FU对细胞周期的影响Figure 1 Effects of ARHI and 5-FU on cell cycle

图2 ARHI与5-FU对cyclin D1表达的影响Figure 2 Effects of ARHI and 5-FU on cyclin D1 expression

2.3 ARHI对5-FU诱导的细胞凋亡的影响

以稳定转染pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-ARHI的BGC-823细胞系为模型，5-FU刺激细胞后，通过流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果表明：pIRES2-EGFP组细胞凋亡率为0.61%±0.07%；pIRES2-EGFP-ARHI组细胞凋亡率为0.67%±0.09%，与pIRES2-EGFP组相比未发生明显变化；而5-FU刺激后导致细胞发生明显的凋亡，凋亡率为7.22%±1.55%(P<0.01)；ARHI与5-FU联合导致更为显著的细胞凋亡，凋亡率达到17.34%±2.81%(P<0.01，见图3)。

2.4 ARHI与5-FU对Bax/Bcl-2比值及caspase-3活化的影响

为检测ARHI和5-FU引起BGC-823细胞凋亡的分子机制，采用Western blot检测Bax、Bcl-2及caspase-3剪切体的表达变化，结果表明：ARHI对Bax、Bcl-2及活化caspase-3的表达没有影响；5-FU促进Bax表达而抑制Bcl-2表达，即导致Bax/Bcl-2比值升高，同时增加了caspase-3剪切体的表达；ARHI与5-FU联合作用进一步显著提高了Bax/Bcl-2比值及caspase-3剪切体的表达(见图4)。

与pIRES2-EGFP组比较，**P<0.01 图3 ARHI与5-FU对细胞凋亡的影响 Figure 3 Effects of ARHI and 5-FU on cell apoptosis

图4 ARHI与5-FU对Bax、Bcl-2及活化caspase-3表达的影响Figure 4 Effects of ARHI and 5-FU on expression of Bax, Bcl-2, and activated caspase-3

3 讨论

Yu等[4]于1999年最早发现了ARHI基因，该基因为母系印记基因，其在正常卵巢和乳腺细胞中高表达，在卵巢癌和乳腺癌细胞中缺失或低表达。随后的研究发现ARHI在胰腺癌、肝癌、甲状腺癌、骨肉瘤、胶质瘤、肺癌等其他肿瘤中也表现出低表达或缺失[2,5]。ARHI低表达或缺失的原因包括杂合性丢失、DNA甲基化修饰、组蛋白去乙酰化修饰、转录调控等[2]。重新表达ARHI能够通过多种机制抑制肿瘤细胞的恶性表型[6]。

本课题组前期发现ARHI在胃癌组织及细胞系中表达明显下调或缺失，而在正常胃组织中普遍表达，且ARHI表达与患者肿瘤的分化程度及TNM分期有关。同时发现过表达ARHI能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[3,7]。5-FU是消化系统肿瘤最常用的化疗药物，但在临床应用过程中同样面临耐药性问题，因而提高肿瘤细胞对5-FU的敏感性具有重要价值。近期研究表明,ARHI能够显著提高卵巢癌细胞对顺铂(cisplatin)的化疗敏感性[8]。本研究发现过表达ARHI可导致BGC-823胃癌细胞发生G1期阻滞，同时增强了5-FU诱导的细胞周期阻滞。虽然ARHI对凋亡没有影响，但明显增强了5-FU诱导的凋亡。

cyclin D1在细胞周期由G1期进入S期过程中发挥关键作用[4]。Bax、Bcl-2是细胞凋亡线粒体通路中的关键分子，Bax促进凋亡而Bcl-2抑制凋亡，二者比值变化可以反映细胞凋亡趋势变化。caspase-3是细胞凋亡执行的关键分子，未活化的前体分子量为32/35 kD，活化后剪切为17/19 kD[6,8]。Yu等[4]研究发现过表达ARHI能够降低cyclin D1的表达，从而抑制卵巢癌和乳腺癌细胞的增殖。Washington等[8]发现ARHI可通过抑制Bcl-2的表达而促进卵巢癌细胞凋亡。本研究同样发现ARHI导致G1期阻滞的同时可抑制cyclin D1的表达。虽然单独表达ARHI并不抑制Bcl-2的表达，但可增强5-FU对Bcl-2表达的抑制效应，并增强Bax表达，最终提高Bax/Bcl-2比值、活化caspase-3而导致细胞凋亡。总之，本研究结果表明ARHI可提高胃癌细胞对5-FU的化疗敏感性，有待于更深入研究其机制及体内实验。

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[4] Yu Y,Xu F,Peng H,etal.NOEY2(ARHI),an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1999,96(1):214-219.

[5] Ye K,Wang S,Wang J,etal.Zebularine enhances apoptosis of human osteosarcoma cells by suppressing methylation of ARHI[J].Cancer Sci,2016:Epub ahead of print.

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[7] 唐海灵，胡益群，杨奕轩，等.抑癌基因ARHI在人胃癌组织中的表达及意义[J].世界华人消化杂志，2011，19(1):25-30.

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Effects of ARHI on 5-FU-induced gastric cancer cell cycle arrest and apoptosis

TANG Hailing, ZHUANG Kun, ZUO Liping, ZHANG Xin, YANG Zhenwei, HAN Kun*

(DepartmentofGastroenterology,Xi’anCentralHospital,Xi’an710003,China;*Correspondingauthor,E-mail:hankun411@163.com)

ObjectiveTo elucidate the effects of ARHI on 5-FU-induced gastric cancer cell cycle arrest and apoptosis.MethodsBGC-823 gastric cancer cells were stably transfected with recombinant plasmid vector pIRES2-EGFP or pIRES2-EGFP-ARHI for the experiments. After 5-fluorouracil(5-FU) stimulation, flow cytometry was used to detect the changes of cell cycle and apoptosis. Western blot was used to detect the protein expression levels of cyclin D1,Bax,Bcl-2 and activated caspase-3.ResultsBoth ARHI and 5-FU induced G1phase arrest in BGC-823 cells,and the percentage of G1cells increased to 61.64%±4.56%(P<0.05) and 65.71%±4.89%(P<0.01), respectively. The combined effect of ARHI and 5-FU was more significant, and the percentage of G1cells increased to 81.14%±5.63%(P<0.01). ARHI and 5-FU-induced G1phase arrest was accompanied by down-regulated protein expression of cyclin D1. ARHI had no effect on BGC-823 cell apoptosis,and 5-FU was able to induce significant apoptosis with an apoptotic rate of 7.22%±1.55%(P<0.01). The combined effect of ARHI and 5-FU was more significant, and the apoptotic rate increased to 17.34%±2.81%(P<0.01). 5-FU alone or ARHI and 5-FU-induced BGC-823 cell apoptosis were accompanied by increased Bax/Bcl-2 ratio and activated caspase-3 expression.ConclusionARHI can enhance 5-FU-induced cell cycle arrest and apoptosis in gastric cancer cells.

gastric cancer; tumor suppressor gene; ARHI; 5-Fluorouracil; cell cycle; cell apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81502084)

唐海灵，男，1980-07生，硕士，主治医师，E-mail：xasthl@163.com

2016-11-30

R735.2

A

1007-6611(2017)01-0026-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.01.006