纳米零价铁对耐四环素菌耐药特性的影响

陆 贤,郭美婷*,张伟贤(1.同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海 200092；2.同济大学环境科学与工程学院,上海 200092)

纳米零价铁对耐四环素菌耐药特性的影响

陆 贤1,2,郭美婷1,2*,张伟贤1,2(1.同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室,上海 200092；2.同济大学环境科学与工程学院,上海 200092)

研究了纳米零价铁对污水中耐四环素菌的影响.在不同浓度、反应时间和含氧条件下用纳米零价铁对耐药细菌进行处理.结果表明,当纳米零价铁终浓度为5000mg/L,反应时间为12h,厌氧条件下,纳米零价铁对耐四环素菌有较好的抑制效果.纳米零价铁对细菌的耐药能力有消极作用,因而引起耐药性的减弱.50mg/L浓度的纳米零价铁较大提高了基因转移效率,为原来的2.15倍,因此需综合评估纳米零价铁对耐药性的影响.

纳米零价铁；耐四环素菌；耐药特性；基因转移

医疗和养殖等行业抗生素的过量使用极大加剧了细菌的耐药性风险,对公共健康和疾病预防治疗带来极大威胁.耐药细菌的环境行为是当前研究的热点问题之一,城市污水厂由于汇集多种抗生素及浓度较高的细菌,成为环境中耐药污染物的重要储存库,已在污水中检出多种类型的耐药细菌及耐药基因[1-2].

纳米材料由于具有突出的理化特性近年来得到广泛应用.纳米材料的环境影响,特别是生物效应也引起广泛关注.研究表明,纳米材料对细菌具有明显的生态毒性.Li等[3]发现新鲜合成的未负载的纳米零价铁在较低浓度下有毒性.纳米材料对微生物的毒性可能受多种因素影响[4]. Cristian等[5]发现纳米材料能使耐药细菌光钝化.纳米材料可能导致细菌发生氧化应激反应破坏细胞[6].

污水是纳米颗粒排放到环境的重要汇集地.已有多种纳米颗粒在污水中被检出,其浓度可达μg/L～mg/L[7-8].耐药细菌作为特殊的微生物,毋庸置疑将受到纳米材料的影响,可能对其后续生态风险产生显著变化.然而至今,纳米颗粒对耐药细菌归趋的研究仍较少.本研究以纳米零价铁作为代表,考察其对耐四环素大肠杆菌归趋特性的影响,从其生态毒性、耐药特性和基因转移特性影响等 3个方面评价,以期为评价纳米颗粒对耐药细菌环境风险的影响提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 纳米零价铁悬浊液的制备

纳米零价铁按照文献[9]描述的方法进行制备,即使用NaBH4和Fe(NO3)3⋅9H2O通过化学反应制备.合成后的纳米零价铁颗粒用去离子水冲洗2次(4000r/min离心5min).制备的纳米零价铁储存液浓度为1g/L.

1.2 污水中耐四环素大肠杆菌的筛选

取污水厂活性污泥混合液稀释一系列梯度后取1mL分别加入至含四环素(36mg/L)或红霉素(32mg/L)的大肠杆菌或粪肠球菌选择性培养基中,充分振荡混合,冷却凝固后置于培养箱 37℃培养24h;从各含有抗生素的平板中分别挑4～5株菌落接种至液体 LB培养基中,于摇床中恒温培养 24h;将培养后的菌液于含相应抗生素的斜面LB培养基进行划线分离,培养24h后挑取3株单菌落于液体LB培养基中37℃培养24h;以1%量将上述菌液扩培后分装于 2mL离心管,加入 20%甘油-80℃保存;另各取一管上述纯菌液送出测序,将测序结果输入genbank经blast比对,发现符合大肠杆菌K12的序列.

1.3 耐四环素菌落数统计

采用改进的传统平板法进行.取经纳米零价铁处理后的菌液 1mL,10倍梯度稀释,之后加入到滴有四环素的LB培养基上混合均匀.四环素的浓度为 36mg/L.平板冷却凝固后在37℃培养箱内培养24h.每个梯度设置3个平行样本.统计细菌数量在20～300CFU的平板中菌落数目.将不经过纳米零价铁处理的样品同样进行上述操作作为空白.

1.4 纳米零价铁毒性影响因素研究

将各不同终浓度(2,10,50,100,200,500,1000, 2000,5000mg/L)的纳米零价铁加入到一定体积的耐药细菌纯菌液中,混合液在 5mL离心管中,150r/min下与常温摇床反应15min.为考察反应时间的影响,设定时间分别为5、15、30、45、60min、12、24、48h,反应的纳米零价铁终浓度为 2mg/L;为考察氧气含量影响,参考了 Diao等[4]的方法,将2mL离心管作为缺氧条件,10mL离心管作为有氧组进行反应.所有的反应在室温下进行的.

1.5 耐四环素大肠杆菌的耐药特性实验

测定纳米零价铁处理后耐药细菌的耐药特性变化.简要地,将处理后的耐药细菌分别加入至含不同浓度的四环素(36,100,200,300,400,500, 800mg/L)的LB平板,在37℃下培养24h,记录存活细菌的数目.将未经纳米零价铁处理的细菌作为空白样品同样进行测定.

1.6 纳米零价铁对耐药基因转移的影响

本实验中,纳米零价铁终浓度分别为 2,10,50, 200mg/L.采用培养接合法进行耐药基因的转移,将筛选的耐四环素大肠杆菌 K12作为供体菌,将大肠杆菌NK5449(中国普通微生物菌种保藏管理中心购买,对利福平(＞160mg/L)和萘啶酮酸(＞50mg/L)有很高的抗性)作为受体菌,反应后考察.将供体菌和受体菌分别接种到LB液体培养基培养至对数期,将菌液离心弃上清液后用污水厂二沉池过膜的过膜污水重新悬浮使OD600在1.0左右;将等量供体菌和受体菌混合后置于摇床培养18h;用同时含四环素(浓度为36mg/L)和利福平(浓度为40mg/L)的LB平板筛选转移接合子,用含利福平的LB平板筛选受体菌,对接合子和受体菌分别计数后将二者的比值作为接合频率.

1.7 数据分析

1.7.1 耐四环素细菌的剂量-反应曲线 反应混合液样品总的细菌抗生素抗性水平是用以下方法估算的.对四环素有抗性的细菌的剂量反应曲线数学上与含有四个参数的逻辑方程相吻合

[10].方程如下:

式中:存活率表示为平板上加入四环素与不加入四环素的细菌数量的比值;a表示不加入抗生素的数值,初始值为 100;b表示无穷大,初始值为0;y表示半抑制浓度,mg/L;x表示抗生素,mg/L;p表示决定曲线陡峭程度的坡度因子.

逻辑剂量反应曲线用origin软件进行拟合.

1.7.2 抗生素浓度区间耐药细菌阶段存活率的估算 细菌的存活率用来估计在每一个抗生素浓度区间的细菌耐药水平.浓度区间的细菌存活率用以下公式表示:

式中:存活率(%)a表示抗生素浓度为a mg/L时的细菌存活率;存活率(%)b表示抗生素浓度为 b mg/L时的细菌存活率.

1.7.3 抗生素对耐药细菌抑制率的计算方法

1.7.4 转移效率的计算方法

1.7.5 统计分析 使用卡方检验法检验数据的显著差异性(P≤0.05).

2 结果与讨论

2.1 纳米零价铁对耐药细菌生态毒性及相关因素影响

如图 1a,当纳米零价铁浓度较低时(＜200mg/ L),抑制率较低,在 200mg/L为 21.2%.此结果和Chen等[11]报道类似;当纳米零价铁浓度大于500mg/L时,抑制率显著提高,当纳米零价铁浓度为5000mg/L时,抑制率达45.5%. Bahareh等[12]用纳米氧化钙处理细菌,证实了最好的抑制效果出现在高浓度纳米颗粒的实验条件下.另外,Wang等[13]发现随着纳米二氧化钛浓度的增加,存活的细菌数量显著减小.因此,作为一种纳米材料,高浓度的纳米零价铁悬浊液对耐四环素菌大肠杆菌有较显著的抑制效果.

纳米零价铁和耐药细菌反应时间对耐四环素菌的影响见图1b.当反应时间从5min至30min时,纳米零价铁对耐药细菌的抑制率没有很明显的区别.而当反应时间继续增加,抑制率增加的速率明显加快,从45min时的24%到12h的80%.当反应时间进一步增加,纳米零价铁对耐药细菌反而具有促进作用而非抑制作用.24h和 48h反应时间下的促进率分别为 47%和 103%.当反应时间增加时,纳米零价铁和细菌的反应变得越来越稳定,最大的抑制率在反应时间 12h处得到.Raphael等[14]指出,纳米材料表面的死细菌会阻止纳米材料与活细菌的直接表面接触进而导致纳米颗粒抗菌能力的消失.这也可能是因为,随着接触反应时间延长,纳米零价铁被氧化,失去其抑制耐药菌的能力.而此时氧化的纳米零价铁作为载体,提供了耐药菌繁殖的条件,促使其数量增加.具体原因还有待于进一步研究.

图1 a.纳米零价铁浓度对耐四环素菌抑制的影响;b.反应时间对耐四环素菌抑制的影响;c.氧气含量对耐四环素菌抑制的影响Fig.1 a.influence of nZVI concentration on tetracycline resistant bacteria inactivation; b.influence of reaction time on tetracycline resistant bacteria inactivation; c.influence of redox state on tetracycline resistant bacteria inactivation

2.2 氧含量的影响

反应条件是否有氧对纳米零价铁对耐药菌的灭活率有明显影响.如图 1c所示,有氧条件下,当纳米零价铁浓度增加,细菌存活率增加.而厌氧条件下耐药菌的存活率相比要低.这可能是因为纳米零价铁在有氧条件下更容易被氧化,从而失去其抑制耐药菌的能力.因此,反应中低的氧气含量能保证较高的耐药菌抑制率.

2.3 纳米零价铁对细菌耐药图谱的影响

加入一定浓度纳米零价铁对耐药菌的耐药图谱有一定影响.相比于对照样,投加纳米零价铁的耐药菌图谱向左偏移;但随着纳米零价铁浓度升高,存活曲线趋近于空白样.如图2所示,从半抑制浓度结果看,当纳米零价铁浓度分别 0,2, 10mg/L时,四环素的半抑制浓度分别为 335.3, 210.7,307.2mg/L.这表明,加入的纳米零价铁协同四环素增加了对耐四环素菌的灭活.但随着纳米零价铁浓度的增加,其协同效果有所降低.这可能是因为浓度较高的纳米零价铁反而限制了耐药菌与纳米零价铁的接触,从而导致其抑制效果降低.

图2 不同纳米零价铁浓度反应后耐药细菌的抗生素浓度-存活率曲线Fig.2 Tetracycline concentration-survival rate curve of tetracycline resistant bacteria under different nZVI concentration

图 3表示了四环素各浓度范围内的耐四环素菌的阶段耐药率.对于阶段存活率,将四环素浓度分为36～200, 200～400和400～800mg/L,分别代表低、中和高抗生素浓度.对于低四环素浓度,加入纳米零价铁后,存活率要大于空白.即在低抗生素浓度范围内,加入纳米零价铁可促进耐药菌生长,这种促进作用的原因还不明确.然而,对于中浓度的四环素,加入纳米零价铁意味着更低的存活率.而对于高浓度四环素,不同纳米零价铁浓度下的阶段存活率互为接近,这是因为四环素浓度足够高,以至85%细菌被杀灭;而此时的纳米零价铁作用已不凸显.阶段存活率结果表明,纳米零价铁对耐药菌阶段耐药率的影响与抗生素浓度有关;两者在不同浓度下的协同作用有待进一步深入研究.

图3 四环素各浓度范围内的耐四环素菌的阶段耐药率Fig.3 Stage survival under different tetracycline concentration

图4 不同纳米零价铁反应后耐药基因的转移频率Fig.4 Influence of nZVI concentration on bacteria transfer efficiency

图 4表示了不同纳米零价铁反应后耐药基因的转移频率.可以看到,较低浓度下,纳米零价铁对转移效率有积极影响.转移效率相对于空白分别提高了19.2%(纳米零价铁浓度为2mg/L)和115%(纳米零价铁浓度为50mg/L).转移效率在纳米零价铁浓度为 50mg/L时达到了峰值,此时转移效率为 5.6×10-6.然而,当纳米零价铁浓度增加到200mg/L时,转移效率的增加反而有所降低,转移效率为 2.8×10-6.这与 Qiu等[15]的研究结果相似.他们研究发现,纳米氧化铝、纳米二氧化钛、纳米二氧化硅和纳米氧化铁都能促进质粒的转移.对于纳米氧化铝,对 RP4的转移效率在5mmol/L时达到顶峰,而在50mmol/L减小.

3 结论

3.1 纳米零价铁浓度为5000mg/L时,其对耐四环素菌有较好的抑制效果,抑制率为 45.5%.当反应时间为12h时,抑制率达80%;3.2当反应时间为48h时,纳米零价铁对耐四环素菌具有促进作用. 3.3纳米零价铁削弱细菌耐药程度并促进基因转移.转移效率在纳米零价铁浓度为 50mg/L时达到最大,为5.7×10-6.目前,纳米零价铁对细菌影响的报道较有限.本研究可对该方面提供一些重要信息.需要进一步研究纳米零价铁抑菌特性和机理.未来的研究重点应该聚焦更多的纳米材料对耐药细菌去除和基因转移的影响,以期获得更全面的了解.

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致谢：作者感谢污水处理厂提供的污水样品.

Influence of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on resistance character of tetracycline resistant bacteria.

LU Xian1,2, GUO Mei-ting1,2*, ZHANG Wei-xian1,2
(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China；2.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：381～385

Effect of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on tetracycline resistant bacteria in wastewater was investigated. Specifically drug resistance, gene transfer, microbial growth and separation in municipal wastewater were examined. Tetracycline resistant bacteria were treated with nZVI particles under a verity of experimental conditions such as concentration, reaction time, availability to dissolved oxygen and redox state. Experimental results suggest that nZVI was effective for the inactivation of tetracycline resistant bacteria when nZVI concentration is over 5,000mg/L, or reaction time was over 12hours under anaerobic condition. nZVI could also trigger rapid decrease on the antibiotic resistance. Furthermore, addition of 50mg/L nZVI could enhance the transfer efficiency by 215%. Results demonstrate that nZVI was highly reactive in wastewater and there was an urgent need to understand the influence of nZVI on microbial drug resistance.

nZVI；tetracycline resistant bacteria；resistance character；gene transfer

X172

A

1000-6923(2017)01-0381-05

陆 贤(1990-),男,上海崇明人,同济大学硕士研究生,研究方向为纳米零价铁的应用研究.

2016-05-20

国家自然科学基金资助项目(51308399) * 责任作者, 副教授, guomeiting@tongji.edu.cn