基于响应面法优化一株低温耐盐芘降解菌共代谢条件的研究

刁 硕,王红旗,吴枭雄,赵一村 (北京师范大学水科学研究院,北京 100875)

基于响应面法优化一株低温耐盐芘降解菌共代谢条件的研究

刁 硕,王红旗*,吴枭雄,赵一村 (北京师范大学水科学研究院,北京 100875)

为了提高低温耐盐芘降解菌DYC-1的共代谢降解率,在已获悉菌株降解最优pH值、初始浓度、摇床转速和接菌量的情况下,利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响菌株DYC-1降解PAHs芘的3个外加碳源显著影响因子为葡萄糖、水杨酸和菲,用最陡爬坡实验逼近3个因子的最大响应区域,采用Box-Behnken实验设计及响应面法分析,确定其最优共代谢条件为:葡萄糖225.83mg/L,水杨酸112.10mg/L,菲198.06mg/L;在此条件下培养10d,芘降解率可达到50.69%,相对于不加共代谢底物时提升了23.14%.表明响应面法对菌株共代谢条件的优化合理可行.

响应面法；共代谢；优化；降解菌

多环芳烃(PAHs)是一类普遍存在于环境中的具毒有机污染物[1],在土壤中具有较高的稳定性,生物可降解性随着苯环数和苯环密集程度增加而降低,尤其四环以上的高分子量 PAHs,通常以共代谢的方式降解[2-3].芘作为典型的稳定性PAHs,对其共代谢条件的研究势在必行.

近年来,已有诸多学者进行关于芘降解条件优化的实验.孙凯等[4]从长期受 PAHs污染的植物体内分离筛选出了两株能以芘为唯一碳源和能源的内生细菌BJ03和BJ05,并验证了添加C、N源能够有效的提高两株菌的生长速率,加速对芘的降解;段燕青等[5]通过实验证明了米曲霉以芘为单基质代谢时,降解率为33%.一些学者对菌株的选择更地域化,Patel等[6]验证了海洋微藻集胞藻对芘的降解率可达到36%;Obayori等[7]则首次从撒哈拉以南非洲地区环境中筛选出了 3株高芘降解率的假单胞菌.

共代谢作为一种独特的代谢方式,可能使某些难降解有机污染物被彻底降解[8].共代谢过程中为保证微生物的生长,需从一级基质获得碳源和能源,同时为保证较高的共代谢降解率,需要控制一级基质与二级基质的浓度比.已有研究[9]得出共代谢底物葡萄糖与目标污染物丁基黄药的质量比为4:1时能达到较好的降解效果.因此,选取促进微生物降解的共代谢基质并探索最佳降解条件的优化工作就显得尤为重要.

响应面方法RSM是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法,是数学方法和统计方法结合的产物,已被广泛应用到微生物培养基优化中,但以响应曲面法来优化芘共代谢降解条件的研究比较少.王欣等[10]利用响应面法对乙酰甲胺磷UV-TiO_2/类Fenton光催化降解过程进行了优化,验证值达到了 99%.尹亮[11]在混合菌群共培养对偶氮染料的协同脱色及降解的研究中,运用响应面设计法对共代谢脱色中的 3个主要因素葡萄糖、氯化铵、染料浓度进行了优化,尹亮的研究中虽然其使用了响应面法进行了优化,但较少的外源研究对象使得实验结果具有局限性.当共代谢降解目标污染物时,选取的共代谢底物不同、浓度不同都将对共代谢效果产生不同影响,因此选用响应面优化分析多种共代谢底物对降解率的影响,可有效提高微生物对难降解有机物的降解率,为治理 PAHs污染土壤提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 菌株来源

本研究从天津滨海湿地石油污染地区采集土壤样品,采用定时定量转接、间歇式逐步提高PAHs浓度的方法,通过”土壤菌悬液制备-初筛-保存混合菌及分离纯化-复筛-保存菌株”的步骤,获得了一株可以在低温高盐条件下降解 PAHs芘的单菌株 DYC-1.经鉴定为红球菌.现保存于中国科学院微生物保藏中心.

1.2 药品与试剂

所使用的主要药品试剂:芘、菲(分析纯,日本TCL公司);芴、邻苯二甲酸、邻苯二酚(分析纯,美国Sigma公司);水杨酸、葡萄糖、联苯、醋酸钠(分析纯,国药集团化学试剂北京有限公司);酵母粉(分析纯,OXOID公司);正己烷、乙腈、丙酮(分析纯,美国J.T.Baker公司).

1.3 实验方法

1.3.1 单因子实验 在浓度为 20mg/L的芘无机盐液体培养基中分别加入 100mg/L葡萄糖、芴和菲,50mg/L邻苯二甲酸、水杨酸、邻苯二酚、联苯、醋酸钠和酵母膏[12-19],然后接入5%菌悬液,同时设置不接菌对照和不添加共代谢底物对照,10℃恒温摇床上110r/min培养 10d,每个处理做3个重复,采用高效液相色谱法测芘降解率.

1.3.2 响应面优化

(1) Plackett-Burman(PB)实验设计

PB实验法能够从众多的自变量中快速、有效地筛选出最为重要的影响因子[20].因此,在单因素实验基础上对共代谢条件下降解芘的培养基中5种共代谢基质进行全面考察,这5种共代谢基质分别是:葡萄糖、水杨酸、邻苯二甲酸、邻苯二酚和菲.选用N=11的PB实验设计,并余留5个空项作误差分析,确定众因子相对于响应变量芘的降解率的显著性.

采用 Design expert 8.0 软件来设计PB实验,PB实验设计表如表1所示.

按照 PB实验表配置各组培养基,共 12组,每组设置3个平行重复.同时配置不接菌及不添加共代谢底物作为对照组.每瓶培养基接入 5%菌悬液,10 ℃,110r/min 摇床培养10d,采用高效液相色谱法测芘降解率.将响应值输入系统中,查看各因子的 P值,进行显著性评价.当整体 P＜0.05说明实验结果可信,实验成功,P值最小的3个即为最显著的 3个因子,同时要求这 3个因子P＜0.05.取这3个最显著因子做下一步实验.

表1 PB实验因素及水平Table 1 Experimential factors and levels of Plackett-Burman

(2)最陡爬坡实验

PB实验中获得了对响应值影响最为显著的3个因子,对这3个因子做爬坡实验,设置5个梯度,按照实验要求配置培养基,每个梯度3个平行重复,同时配置不接菌及不添加共代谢底物作为对照组.每瓶培养基接入 5%菌悬液,10 ℃, 110r/min摇床培养 10d,采用高效液相色谱法测芘降解率,最终确定后续响应面实验中3因子的浓度范围,确定中心组合法的中心点.

(3)响应面实验

确定本研究的3个主要影响因素:葡萄糖、水杨酸、菲.选用响应面分析法的 Box-Behnken实验,采用3因素3水平的响应面分析,设计了共17组实验,每个梯度3个平行重复,同时配置不接菌及不添加共代谢底物作为对照组.每瓶培养基接入 5%菌悬液,10℃ ,110r/min 摇床培养10d,采用高效液相色谱法测芘降解率.

1.3.3 优化验证实验 为考察优化共代谢培养基后,目标污染物的降解率及菌株生物量之间的关系,分别对投加最佳共代谢底物配方前后的菌株DYC-1生物量和菌株DYC-1对芘的降解率进行测定.将菌株DYC-1(接菌量为5%)分别接种于含有 20mg/L芘的基础无机盐培养基和投加了最佳共代谢底物配方的无机盐培养基中,10℃恒温摇床上 110r/min培养 10d.菌株生物量测定采用光密度法,每24h取发酵液进行分析,以MSM培养基作为空白对照,于600mm下用紫外分光光度计测定发酵液的吸光值来表征菌株生物量.菌株对芘的降解率的测定方法同1.3.1.

2 结果与讨论

2.1 单因子实验

本实验室先前的研究已获取了红球菌DYC-1在降解芘的最优 pH值(8)、初始浓度(20mg/L)、摇床转速(110r/min)及接菌量(5%),即菌株在低温 10 ,℃盐度为 2%的条件下能达到较高的降解率.为了进一步提高降解率,现考察葡萄糖、水杨酸、邻苯二酚、邻苯二甲酸、醋酸钠、酵母、联苯以及菲、芴作为外加碳源对芘降解率的影响.其中,CK1为不接菌且不加共代谢底物的对照,CK2为接菌但不加共代谢底物的对照.

图1 不同共代谢底物对芘降解率的影响Fig.1 Effect of different cometabolizing substrates on pyrene degradation rate

结果表明,在不同共代谢底物存在时菌株DYC-1的降解率不同.葡萄糖、菲、邻苯二甲酸、水杨酸、邻苯二酚5种共代谢物质都可以促进芘的微生物降解,其中水杨酸对降解的促进作用最好,究其原因,可能是水杨酸是芘的中间代谢产物之一,能诱导相关酶的表达,从而促进芘的降解,巩宗强等[21]、钟鸣等[17]、周乐等[22]也有类似报道;同样,邻苯二酚和邻苯二甲酸也是芘的中间代谢产物,同样促进降解;葡萄糖作为速效碳源,是微生物生长所需的营养物质,它的存在可以促进菌株的生长繁殖,加强菌体生命活动,从而促进芘的降解,胡凤钗等[19]向分枝杆菌 N12分别投加了0～5000mg/L的葡萄糖作为共代谢物质,发现均促进了菌株 N12对芘的降解,王蕾等[18]的研究也获得了相似结论,但这与钟鸣等[17]的研究相反,这可能是葡萄糖会抑制钟鸣研究的寡养单孢菌属对芘的优先利用或相关降解酶的活性表达;实验中选择在结构上与芘相似,且较易降解的PAHs化合物菲作共代谢底物也取得了很好的效果,降解率为32.78%,何晶晶[23]也有类似报道,且根系土壤内芘的降解在有菲的存在下得到了促进.而联苯、醋酸钠以及酵母粉对菌株降解芘的促进效果不明显,甚至加入共代谢底物芴会抑制芘的微生物降解,对照CK1芘的降解率仅为0.72%,可以忽略不计.

可见不同的共代谢产物,对体系中芘降解率会产生一定程度的影响,共代谢底物的选择是应用共代谢作用降解芘的关键问题之一[24].

2.2 响应面优化

2.2.1 PB实验结果 通过单因子实验确定5种共代谢底物——葡萄糖、水杨酸、邻苯二甲酸、邻苯二酚及菲,设计PB实验确定对响应值降解率影响显著的因子,对每一个影响因素分别取高低两个水平进行实验设计,实验设计及结果见表2.

表2 PB实验表Table 2 Experimental table of Plackett-Burman

帕累托图(Pareto Chart)分析如图2,确定三个最显著的因子分别为:葡萄糖 0.0004、水杨酸0.0122以及菲0.0012.PB.实验整体P＜0.05,且葡萄糖、水杨酸及菲三因子P＜0.05,说明实验结果可靠,实验成功,因此通过PB实验确定对芘降解率影响显著的三个因子分别为葡萄糖、水杨酸及菲.

图2 显著因子对应帕累托图Fig.2 Pareto Chart of each significant factor

由PB实验结果分析得到一次回归方程:

式中:Y代表降解率,A、B、C、D、E分别代表葡萄糖、水杨酸、邻苯二甲酸、邻苯二酚、菲浓度.该方程决定系数R2=0.9419,表示方程回归良好.

2.2.2 最陡爬坡实验 根据 PB实验中各因子的变量系数来决定最陡爬坡实验的爬坡方向,回归方程中葡萄糖、水杨酸及菲这3个因子的系数都为正,即都呈现正效应,所以在最陡爬坡实验中,3个因子的浓度都应增加,最陡爬坡实验设计及结果如表3所示.

表3 最陡爬坡实验设计及实验结果Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

由表3可知,实验4中响应值芘降解率最高,且随着步长增加,降解率降低,因此最优点在此附近,因此共代谢培养基以葡萄糖(200mg/L)、水杨酸(100mg/L)、菲(200mg/L)作为Box-Behnken实验的中心点进行响应面实验对共代谢培养基进一步优化.

2.2.3 响应面实验 邻苯二甲酸、邻苯二酚保持在最高水平不变,根据最陡爬坡实验得到的中心点对葡萄糖、水杨酸、菲进行中心组合实验(5个中心点),一共17组实验,实验结果以PAHs芘的降解率作为表征参数,实际结果和预测结果见表4.

由表4可以看出,实际观测值与预测值的拟合程度较好.由表5可以看出,模型整体P＜0.0001,表明此回归模型显著.同时模型回归系数R2=0.9999,调整回归系数 R2adj.= 0.9997,预测回归系数 R2pred.=0.9981,表明菌株对芘的降解率的实测值与预测值之间具有较好的拟合度,这从表4也可以看出,因此所选取模型的拟合度较好,可用于分析和预测响应值芘降解率的变化,指导实验优化.同时模型的F值为6172.75,失拟项仅为21.42,较高的F值对应不显著的失拟值,表示模型的拟合度较好.同时,在选取的自变量范围内,模型对实验数据的拟合程度较好,可以用于对各响应值之间变化以及相互关系的分析.

表4 Box-Behnken实验设计结果Table 4 Experimental design and results of Box-Behnken optimization experiments

实验结果的方差分析见表 5.从表 5的分析结果可以看出,葡萄糖(A)、水杨酸(B)和菲(C)的P值都小于0.0001,它们对模型的影响极其显著,这表明葡萄糖、水杨酸、菲是菌株DYC-1降解芘过程中的重要影响因素;其交互项系数AB和AC的P值分别为0.0042和小于0.0001,均小于0.05,这表明在菌株对芘的降解过程中,葡萄糖与水杨酸、葡萄糖与菲之间的交互作用明显;根据回归分析所得到的反映模型的二阶响应曲面拟合方程如下所示:

响应面实验3D图与等高线图如图3所示,从图中可明显看出,模型开口向下,表明试验结果有最大值.由等高线图可知,最大值落在实验范围内.

表5 Box-Behnken实验设计结果分析Table 5 Results of regression analysis of the Box-Behnken design for optimization of pyrene degradation

图3 -a 葡萄糖和水杨酸对芘降解率影响的响应面和等高线Fig.3 -a Response surface and contour plots of the effect of glucose and salicylic acid on degradation of pyrene

图3 -b 葡萄糖和菲对芘降解率影响的响应面和等高线Fig.3 -b Response surface and contour plots of the effect of glucose and phenanthrene on degradation of pyrene

通过响应面模型的拟合分析,得到降解率的最佳共代谢培养基配方为:葡萄糖 225.83mg/L,水杨酸 112.10mg/L,菲 198.06mg/L,此时降解率可达到 50.69%,相对于不加共代谢底物的27.55%提升了23.14%.

2.3 优化验证实验结果

图4 菌株DYC-1的生长曲线Fig.4 Growth curve of sp. DYC-1

菌株DYC-1分别在基础培养基和最佳培养基中的菌株生物量和芘降解率测定结果如图4、图5所示,菌株DYC-1的生长同步于对芘的降解,投加最佳共代谢培养基配方之后,菌株的生物量有所提高,进入对数生长期的时间也有所提前,与此同时,菌株对芘的降解率大幅提升.因此,通过响应面法获得的最佳共代谢培养基在降解目标污染物芘时,具有极大的优势.

图5 菌株DYC-1对芘的降解率Fig.5 Pyrene degradation rate of sp. DYC-1

3 结论

3.1 在单因子实验的基础上,将响应面法应用于优化低温耐盐芘降解菌的共代谢条件.单因子实验考察了9种物质作为外加碳源对芘降解率的影响,选取能够促进芘降解的共代谢底物进行下一步实验,通过 Plackett-Burman实验设计筛选出影响红球菌DYC-1降解PAHs芘的3个显著影响因子为葡萄糖、水杨酸和菲.三者都是菌株 DYC-1降解芘过程中的重要影响因素,且葡萄糖与水杨酸、葡萄糖与菲的相互作用对芘的降解影响显著.

3.2 应用响应面法分析优化设计芘的最佳共代谢培养基条件为:葡萄糖 225.83mg/L,水杨酸112.10mg/L,菲198.06mg/L,在此条件下培养10d,芘降解率可达到50.69%,相对于不加共代谢底物时27.55%的降解率提升了23.14%.

3.3 回归分析和拟合验证实验表明回归模型显著,方法可行.

[1] 巩宗强,李培军,王 新,等.芘在土壤中的共代谢降解研究 [J].应用生态学报, 2001,12(3):447-450.

[2] Heitkamp M A, Cerniglia C E. Polycyclic aromatic hydrocarbon degradation by a Mycobacterium sp. in microcosms containing sediment and water from a pristine ecosystem. [J]. Applied & Environmental Microbiology, 1989,55(8):1968-1973.

[3] Bossert I D, Bartha R. Structure-biodegradability relationships of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 1986,37(1):490-495.

[4] 孙 凯,刘 娟,李 欣,等.两株具有芘降解功能的植物内生细菌的分离筛选及其特性 [J]. 生态学报, 2014,34(4):853-861.

[5] 段燕青,岳秀萍,白凡玉,等.耐受重金属的芘降解真菌的筛选及芘降解动力学研究 [J]. 环境工程学报, 2015,9(2):977-982.

[6] Patel J G, Kumar J I N, Kumar R N, et al. Enhancement of pyrene degradation efficacy of sp. by construction of an artificial microalgalbacterial consortium [J]. Cogent Chemistry, 2015,1(1):1064193.

[7] Obayori O S, Ilori M O, Adebusoye S A, et al. Pyrenedegradation potentials of Pseudomonas species isolated from polluted tropical soils [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008,24(11):2639-2646.

[8] 王晓蓉.环境化学 [M]. 南京:南京大学出版社, 1997.

[9] 鄢恒珍,龚文琪,梅光军,等.共代谢条件下丁基黄药的生物降解实验研究 [J]. 环境污染与防治, 2010,32(4):1-5.

[10] 王 欣,王金翠,殷晓梅,等.乙酰甲胺磷UV—TiO2/类Fenton光催化降解过程的响应面法优化 [J]. 应用化工, 2013,42(1):33-40.

[11] 尹 亮.混合菌群共培养对偶氮染料的协同脱色及降解的研究[D]. 广州:华南理工大学, 2009.

[12] 陈晓鹏,易筱筠,陶雪琴,等.石油污染土壤中芘高效降解菌群的筛选及降解特性研究 [J]. 环境工程学报, 2008,2(3):413-417.

[13] 张宏波,林爱军,刘 爽,等.芘高效降解菌的分离鉴定及其降解特性研究 [J]. 环境科学, 2010,31(1):243-248.

[14] 唐玉斌,马姗姗,王晓朝,等.一株芘的高效降解菌的选育及其降解性能研究 [J]. 环境工程学报, 2011,5(1):48-54.

[15] 张 娜,尹 华,彭 辉,等.嗜麦芽窄食单胞菌 J12对芘的降解特性 [J]. 环境科学与技术, 2010,33(4):6-9.

[16] 温继伟,高大文.偏肿拟栓菌共代谢降解芘条件的优化 [J]. 中国环境科学, 2011,31(9):1516-1522.

[17] 钟 鸣,张佳庆,吴小霞,等.芘高效降解菌的分离鉴定及其降解特性 [J]. 应用生态学报, 2010,21(5):1334-1338.

[18] 王 蕾,聂麦茜,王志盈,等.PAHs降解菌的筛选及其对芘的降解研究 [J]. 环境科学与技术, 2010,33(1):43-47.

[19] 胡凤钗,苏振成,孙 健,等.高效芘降解菌 N12的分离鉴定与降解特性 [J]. 应用生态学报, 2011,22(6):1566-1572.

[20] Reddy L V A, Wee Y J, Yun J S, et al. Optimization of alkaline protease production by batch culture of Bacillus, sp. RKY3 through Plackett–Burman and response surface methodological approaches [J]. Bioresource Technology, 2008,99(7):2242-2249.

[21] 巩宗强,李培军,王 新,等.芘在土壤中的共代谢降解研究 [J].应用生态学报, 2001,12(3):447-450.

[22] 周 乐,盛下放.芘降解菌株的筛选及降解条件的研究 [J]. 农业环境科学学报, 2006,25(6):1504-1507.

[23] 何晶晶.石油烃污染土壤微生物多样性分析及 PAHs降解菌研究 [D]. 乌鲁木齐:新疆农业大学, 2008.

[24] Hayes L A, Nevin K P, Lovley D R. Role of prior exposure on anaerobic degradation of naphthalene and phenanthrene in marine harbor sediments [J]. Organic Geochemistry, 1999,30(8):937-945.

Optimization for pyrene bacteria cometabolism degradation under the low temperature and high salt environment through response surface.

DIAO Shuo, WANG Hong-qi*, WU Xiao-xiong, ZHAO Yi-cun
(College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：345～351

In order to enhance pyrene bacteria cometabolism degradation rate under low temperature and high salt environment, under the circumstances of learned optimal pH, initial concentration of pyrene, shaking rates of rocking bed, inoculating dosage, Plackett-Burman Design was conducted and glucose, salicylic acid and phenanthrene were identified as main factors. These factors were approached to optimal region by steepest ascent design. Then optimal degradation condition(glucose, 225.83mg/L; salicylic acid, 112.10mg/L; phenanthrene, 198.06mg/L) was established by Box-Behnken design and reponse surface analysis. Degradation rate under the optimal consition was 50.69% after 10days, enhanced 23.14% compare to the condition of without cometabolism degradation substrate. Experimental results also showed that the method of optimization for bacteria cometabolism degradation is reasonable and feadible.

response surface methodology(RSM)；cometabolism；optimization；degradation bacteria

X172

A

1000-6923(2017)01-0345-07

刁 硕(1992-),女,山东荷泽人,北京师范大学水科学研究院硕士研究生,从事污染土壤修复与治理研究.

2016-03-21

国家自然科学基金面上项目(41372232);国家“863”项目(2013AA06A205);中国博士后科学基金第54批面上资助项目

* 责任作者, 教授, whongqi310@sohu.com