镰形棘豆总黄酮对3T3-Ll脂肪细胞胰岛素抵抗模型炎症因子的作用*

杨丽霞，范 强，姜良恩，孟祥云，王永胜，刘铜华

(1.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050； 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；3.北京中医药大学，北京 100029)

·实验研究·

镰形棘豆总黄酮对3T3-Ll脂肪细胞胰岛素抵抗模型炎症因子的作用*

杨丽霞1，范 强2，姜良恩2，孟祥云2，王永胜1，刘铜华3

(1.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050； 2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；3.北京中医药大学，北京 100029)

目的：观察镰形棘豆总黄酮对3T3-Ll脂肪细胞胰岛素抵抗模型炎症因子的作用。方法：体外培养小鼠3T3-Ll前脂肪细胞，诱导为正常脂肪细胞，建立胰岛素抵抗细胞模型。实验分为正常对照组,模型对照组,吡格列酮(100mL/L含药血清)组,镰形棘豆总黄酮低剂量组(50mL/L含药血清)、中剂量(100mL/L含药血清)组、高剂量(20 0mL/L含药血清)组6组。药物干预24，48，72h后，取细胞上清，ELISA法检测炎症因子C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子-1(MCP)、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转录因子AP-1(AP-1)的含量。结果：与正常对照组对比，模型对照组的炎症因子水平上升,差别有统计学意义(P<0.05)；经过镰形棘豆总黄酮和吡格列酮药物血清干预后，炎症因子水平不同程度下降，药物的作用随着药物剂量的增高、作用时间的延长而逐渐增强，与模型对照组对比，差别有统计学意义(P<0.05)。结论：镰形棘豆总黄酮在一定程度上可减少胰岛素抵抗细胞模型炎症因子的释放，具有改善胰岛素抵抗的作用。

镰形棘豆总黄酮/药效学；3T3-Ll；胰岛素抵抗；炎症因子；动物模型；大鼠

随着社会经济的快速发展，人们生活节奏加快，生活和工作压力增加，2型糖尿病(type2Diabetesmellitus，T2DM)的发病率越来越高。2 型糖尿病的主要发病环节是胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)，其形成机制目前尚未阐明。近年来，有些研究表明慢性炎症参与了IR的发生与发展，认为IR是非特异性炎症过程[1],因此，干预炎症成为改善IR防治T2DM的新思路。镰形棘豆(Oxytropis falcataBunge)是豆科棘豆属多年生草本植物，藏药称之为“俄大夏”，分布在我国西部地区包括青海、西藏、甘肃、四川等地，具有清热解毒、愈创生肌、止血的功效，可以治疗湿疹、炎症、黄水、肿痛等[2]。既往研究表明：镰形棘豆提取物具有较强的抑菌、抗炎、抗氧化的作用[3-4]。本实验以炎症-IR为切入点，通过观察藏药镰形棘豆总黄酮干预3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型炎症因子释放的作用，探讨其防治IR的作用及其机制，以期为其临床应用提供科学依据，为胰岛素抵抗的预防和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株

小鼠3T3-L1前脂肪细胞株(ATCC)，购自上海拜力生物科技有限公司，货号CL-173。

1.2 动 物

SPF级雄性Wistar大鼠，体质量(200±20)g，购自甘肃中医药大学，许可证号：SCXK(甘)2004-0006。

1.3 药品、试剂与仪器

镰形棘豆，产地青海，由青海优润堂商贸有限责任公司提供；总黄酮，纯度为26.58%，由上海友思生物技术有限公司提取、分离；盐酸吡格列酮片，北京太洋药业有限公司产品，批号130605。小鼠C反应蛋白(CRP)、白介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、核因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转录因子AP-1(AP-1)ELISA试剂盒，均为上海晶天生物科技有限科技公司产品，批号依次为E20160120063、E20160120037、E20160120022、E20160120051、E20160120016、E20160120029。DMEM细胞培养基、胎牛血清，美国Gibco公司产品，批号依次为31600034，16000044。SW-CJ-2FD型超净工作台,无锡凯派克斯科技有限公司产品；MCO-18AIC型CO2培养箱，日本三洋公司产品；OlympusX-71型倒置显微镜，日本奥林巴斯公司产品；RT-6100酶标仪，美国雷杜公司产品。

1.4 镰形棘豆总黄酮含药血清的制备

将雄性Wistar大鼠分为镰形棘豆总黄酮组、吡格列酮组。镰形棘豆总黄酮组按400μg/(g·d)剂量灌胃，吡格列酮组按10μg/(g·d)剂量灌胃,1d2次，连续灌胃3d。于末次灌胃前8h禁食、不禁水；30min后，大鼠股动脉无菌采血；静置2h，3 000r/min冷冻离心20min;取上清，将同组血清混合；56 ℃水浴灭活30min，用1.5mLEP管分装，-20 ℃低温保存备用。

1.5 3T3-Ll细胞胰岛素抵抗模型的建立与分组

将3T3-L1前脂肪细胞置于含100mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基中，于37 ℃、50mL/LCO2培养箱中培养。在细胞生长状态良好时，按实验分组接种于24孔培养板，每组3孔。继续培养，待细胞融合2d后，换用诱导溶液l(含100mL/L胎牛血清、0.5mmol/LIBMX、10mg/L胰岛素、0.25μmol/LDEX的DMEM高糖培养基)培养48h，后换用诱导溶液2(含100mL/L胎牛血清、10mg/L胰岛素)再培养48h，随后以100mL/L的DMEM高糖培养基继续培养，2d换1次培养液，诱导分化8～12d。如上操作后，90%以上3T3-Ll前脂肪细胞可分化为成熟的脂肪细胞。进行油红“O”染色鉴定为脂肪细胞后，方可用于实验。将成熟的3T3-Ll脂肪细胞用含DEXlμmol/L、Insulin10nmol/L和100mL/L胎牛血清的DMEM培养基孵育96h，取培养液上清，采用葡萄糖氧化酶法，以培养基中葡萄糖的消耗量反应胰岛素抵抗情况，建立胰岛素抵抗细胞模型[5]。实验分为6组：正常对照组(正常脂肪细胞)，模型对照组，吡格列酮(100mL/L含药血清)组，镰形棘豆总黄酮低剂量(50mL/L含药血清)组、中剂量(100mL/L含药血清)组、高剂量(200mL/L含药血清)组。

1.6 检测指标

按分组加入1mL含药培养液培养。在培养24,48,72h时收集每孔细胞上清于1.5mL的EP管中，-20 ℃保存待测。采用ELISA检测细胞上清中CRP、IL-6、MCP-1、TNF-α、NF-κB、AP-1的含量。将传代培养的细胞接种在24孔培养板中，每孔接种剂量为1mL，每组接种3孔。检测严格按照试剂盒说明书进行。检测前先对所有样本进行低温离心，在反应孔中加标准品或待测标本，每孔剂量为100μL，在空白对照孔中加入稀释液，剂量为100μL，然后在37 ℃电热培养箱进行孵育，孵育后对检测板进行洗涤，最后加酶标抗体进行酶联免疫反应。反应终止后，将检测板在酶标仪上进行检测，以空白对照孔调零，检测条件为450nm，测定各孔OD值。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组细胞CRP含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞CRP含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随着细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，镰形棘豆总黄酮各剂量组和吡格列酮组的CRP含量均不同程度地降低，且作用持续到72h,较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—10.567±6.52511.898±4.47317.104±2.141模型对照组—36.011±3.985*42.469±3.513*61.739±1.304*吡咯列酮组10022.169±7.376#22.532±2.278#23.703±2.370#镰形棘豆总黄酮低剂量组5018.779±2.357#30.442±4.853#29.877±3.494#镰形棘豆总黄酮中剂量组10020.010±3.093#25.539±2.941#25.277±4.391#镰形棘豆总黄酮高剂量组20019.909±3.728#23.218±4.450#28.001±4.223#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.2 各组细胞IL-6含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞IL-6含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，在药物干预24 h时，镰形棘豆总黄酮高剂量组和吡格列酮组IL-6含量开始降低；在48，72 h时，镰形棘豆总黄酮各剂量组和吡格列酮组的IL-6含量均降低，差别有统计学意义(P<0.05)。见表2。

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—9.497±3.2569.247±4.1996.407±1.159模型对照组—18.150±1.084*30.287±1.778*34.107±1.243*吡咯列酮组10014.377±0.340#16.307±3.311#15.547±3.314#镰形棘豆总黄酮低剂量组5015.230±3.65019.110±4.237#23.110±2.022#镰形棘豆总黄酮中剂量组10015.453±1.36516.890±3.677#20.940±1.795#镰形棘豆总黄酮高剂量组2009.733±0.994#17.663±1.736#15.310±2.966#

注：与正常对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05。

2.3 各组细胞MCP-1含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞MCP-1含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，在药物干预24h时，镰形棘豆总黄酮中、高剂量组和吡格列酮组MCP-1含量开始降低；在48，72h时，镰形棘豆总黄酮各剂量组和吡咯列酮组的MCP-1含量均下降，较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组细胞MCP-1含量对比

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—21.032±2.46720.206±6.54729.385±8.339模型对照组—60.357±7.357*81.489±2.093*98.923±6.506*吡咯列酮组10033.248±12.316#34.701±4.977#41.404±7.104#镰形棘豆总黄酮低剂量组5045.829±6.21050.913±5.449#50.583±5.376#镰形棘豆总黄酮中剂量组10029.385±4.231#42.196±5.218#43.649±5.053#镰形棘豆总黄酮高剂量组20036.022±5.567#40.512±9.780#34.932±3.293#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.4 各组细胞TNF-α含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞TNF-α含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，在药物干预24 h时，镰形棘豆总黄酮中剂量组TNF-α含量开始降低；在48,72 h时，镰形棘豆总黄酮各剂量组和吡格列酮组的TNF-α含量均下降，较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。见表4。

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—85.853±28.90065.923±24.43764.883±9.032模型对照组—172.520±20.694*249.640±32.097*299.460±31.006*吡咯列酮组100137.023±11.663126.437±14.110#158.300±15.593#镰形棘豆总黄酮低剂量组50124.463±28.039185.183±14.328#175.530±10.638#镰形棘豆总黄酮中剂量组100120.103±25.257#126.023±22.183#147.403±11.521#镰形棘豆总黄酮高剂量组200128.097±14.217140.863±17.686#136.607±8.930#

注：与正常对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05。

2.5 各组细胞NF-κB含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞NF-κB含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，在药物干预24h时，镰形棘豆总黄酮各剂量组和吡咯列酮组的NF-κB含量均开始下降，且作用持续到72h,较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。见表5。

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—499.700±95.258278.801±109.704384.448±178.771模型对照组—1204.931±150.624*1415.540±103.198*1885.465±181.915*吡咯列酮组100855.059±27.174#598.487±88.529#917.487±72.773#镰形棘豆总黄酮低剂量组50827.619±99.065#1101.342±59.257#872.210±64.504#镰形棘豆总黄酮中剂量组100587.511±131.464#824.874±127.572#1016.274±109.394#镰形棘豆总黄酮高剂量组200609.463±208.840#575.848±40.869#661.601±105.552#

注：与正常对照组对比，*P<0.05；与模型对照组对比，#P<0.05。

2.6 各组细胞AP-1含量对比

与正常对照组对比，模型对照组细胞AP-1含量增高，差别有统计学意义(P<0.05)，并随细胞培养时间的增加呈递增趋势。与模型对照组对比，在药物干预24 h时，镰形棘豆总黄酮中、高剂量组和吡咯列酮组的AP-1含量开始下降；在药物干预48，72 h，各组药物AP-1的含量均有下降，较模型对照组差别有统计学意义(P<0.05)。见表6。

组 别含药血清/(mL·L-1)24h48h72h正常对照组—428.247±138.349540.891±113.099569.723±67.628模型对照组—1018.290±111.676*1531.896±122.041*1731.036±114.515*吡咯列酮组100641.467±116.082#670.969±166.263#756.123±190.164#镰形棘豆总黄酮低剂量组50807.752±252.611893.577±182.974#1041.087±128.312#镰形棘豆总黄酮中剂量组100566.371±68.833#1024.995±18.436#832.561±184.197#镰形棘豆总黄酮高剂量组200674.992±175.601#776.909±49.367#835.243±210.127#

注：与正常对照组对比，* P<0.05；与模型对照组对比，# P<0.05。

3 讨 论

近年来，糖尿病在我国的发病率逐年上升。据2009年全国糖尿病调查结果显示，我国农村人群糖尿病的发病率为8.2%，城市人群为11.4%，20岁以上成年人的糖尿病患病率平均为9.7%[6]。糖尿病会给我国人民的生活和经济带来巨大的损失。糖尿病的发病因素多而复杂，IR是糖尿病的主要发病环节。IR是指胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性下降，产生的生物学效应低于正常状态，胰岛素的作用没有得到很好的发挥。目前认为，IR与很多代谢性疾病如高血压、高血脂、糖尿病、痛风等有关，是这些疾病的共同病理生理基础。因此，研究改善胰岛素抵抗对于预防糖尿病等许多慢性疾病具有重要的意义。

近年来，众多学者认为慢性炎症与胰岛素抵抗关系密切，并已成为研究热点。机体在免疫功能受损的情况下导致各种炎症因子大量释放，这些炎症因子主要有：TNF-α、白介素(IL-1、IL-6)、MCP-1、蛋白纤溶原激活抑制物-1(PAI-1)、细胞间粘附因子-1(ICAM-l)、血管间粘附分子-1(VCAM-l)、CRP，以及脂肪细胞因子脂联素、抵抗素、瘦素及游离脂肪酸(FFA)等[7,8]。这些炎症因子通过错综复杂的信号网络相互联系、相互影响，通过激活炎症信号通路，抑制胰岛素信号传导，最终导致IR的发生。胰岛素有抗炎作用，研究表明胰岛素可抑制CRP的合成，降低NF-κB效应，抑制TNF-α、IL-6等炎症因子释放。在正常情况下，NF-κB与抑制因子IκB结合，以无活性的形式存在于胞浆内；但在炎症状态时，TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子刺激NF-κB与IκB解离后进入细胞核内，与DNA上的特异靶基因结合，调控炎症因子的基因转录和蛋白合成，启动和扩大炎症反应而导致IR的发生。因此，NF-κB在炎症反应中起着关键的作用，通过抑制NF-κB信号通路可避免IR的发生[9]。

本课题选用的镰形棘豆总黄酮是从藏药镰形棘豆中提取的有效活性成分。研究发现，镰形棘豆内大量的黄酮类化合物及其衍生物主要以黄酮苷、黄酮、二氢黄酮、黄酮醇、查耳酮、二氢查耳酮、异黄烷和黄烷酮等形式存在，具有较强的抗炎、抗氧化作用[10]。近年来，虽然开展了一些有关镰形棘豆化学成分的研究，但其药理作用研究仍然不足，很多研究尚处于初级阶段，对开发我国藏药资源十分不利；因此，加快研究该药材的药用价值，阐明其化学成分和药理活性，开发出疗效确切、稳定的新药是非常必要的。

本实验主要观察了镰形棘豆总黄酮对小鼠3T3-Ll细胞IR模型炎症因子的作用。研究发现，镰形棘豆总黄酮可明显降低IR细胞CRP、IL-6、MCP、TNF-α、AP-1等炎症因子水平，并抑制炎症信号通路关键分子NF-κB的释放。其中，在药物干预48h后，作用较为显著，效果接近吡格列酮。由于脂肪细胞分泌的炎症因子可降低胰岛素的敏感性，参与IR的发生，因此推断，镰形棘豆总黄酮可通过降低炎症因子水平可改善IR。关于镰形棘豆总黄酮干预3T3-L1 脂肪细胞IR的作用靶点和分子生物学机制的研究，将在以后的工作中进一步探讨。

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(编辑 陶 珠)

1001-6910(2017)01-0066-05

R

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.01.31

杨丽霞(1979-)，女(汉族)，甘肃定西人， 副主任医师，博士，研究方向为中、藏药防治糖尿病的作用机制研究。

国家自然科学基金(81202971)

2016-08-12;

2016-12-27