N-烷基酰胺类化合物电喷雾质谱裂解机制的研究

董 洁，冀娇娇，王加利，袁 将，高 简，张亚丽，姬瑞芳，全庆华，谭 鹏，刘永刚

(北京中医药大学，北京 100102)

N-烷基酰胺类化合物电喷雾质谱裂解机制的研究

董 洁，冀娇娇，王加利，袁 将，高 简，张亚丽，姬瑞芳，全庆华，谭 鹏，刘永刚

(北京中医药大学，北京 100102)

为阐明维吾尔族药阿纳其根中N-烷基酰胺类成分的质谱裂解机制，采用电喷雾离子源(ESI)正离子模式进行多级碎片解析，对阿纳其根中分离得到5种N-烷基酰胺类成分：十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺，十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺，十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺，十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺，应用密度泛函(DFT)法比较不同裂解方式的优化结构，并分析其可能的质谱裂解机制。结果表明，在正离子模式下，5种N-烷基酰胺类成分均易形成[M+H]+准分子离子，并进一步发生N-位的α裂解，丢失酰胺结构中胺部分、羰基以及水等而形成碎片离子。该类化合物的裂解规律可为N-烷基酰胺类化合物的结构鉴定和定量分析奠定理论基础。

N-烷基酰胺类成分；电喷雾串联质谱(ESI-MSn)；裂解途径；量子计算化学

N-烷基类化合物多为一端较长不饱和酸和另一端有较少取代基的胺构成的酰胺结构，是广泛存在于菊科、马兜铃科等植物中的一类重要天然产物。据文献报道，N-烷基类成分具有抗病毒、抗炎等药理活性[1]，此外还具有酪氨酸酶激活作用[2]。

目前，关于N-烷基类成分的研究报道多为对其提取物进行LC/MS分析，如，Boonen等[3-4]采用HPLC-UV-ESI-MS法从阿纳其根的乙醇提取物中鉴定了13种N-烷基类成分，从金纽扣的乙醇提取物中鉴定了11种N-烷基类成分，但并未进一步研究这一类单体成分的质谱裂解机制。高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MSn)技术集合了色谱强大的分离能力与质谱优越的定性功能，现已广泛用于中药复杂成分分析和化合物结构鉴定等领域[7-10]，而量子化学计算[11-15]可以辅助推测化合物的电喷雾质谱裂解途径和裂解规律。

鉴于目前对N-烷基类成分物质基础研究的缺乏，本研究拟采用HPLC-ESI-MSn结合量子化学计算方法，对维吾尔族药阿纳其根中分离得到的5种N-烷基酰胺类成分的质谱裂解机制进行研究，以期为N-烷基酰胺类成分的结构鉴定及复杂样品的快速检测和定量分析提供理论依据和方法参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1100 series HPLC色谱仪：美国Agilent公司产品，配有在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、Chem stations色谱工作站等；Agilent 1100 MSD XCT/plus 离子阱质谱仪：美国Agilent公司产品；Satorious十万分之一电子天平：德国Satorious公司产品。

化合物a～e：均由本实验室从阿纳其根(AnacycluspyrethrumDC.)中提取分离制备得到，经核磁共振确定其结构，经HPLC-UV鉴定其纯度达98%以上；乙腈(色谱纯)：美国Fisher Scientific公司产品；甲酸：美国Sigma公司产品；实验用水：屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验条件

1.2.1 样品制备 将2 kg阿纳其根药材粉碎成粗粉，用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次1.5 h，回收溶剂，得到272 g浸膏。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取浸膏，减压回收溶剂，得到40 g二氯甲烷部位。用1.5倍硅胶拌样，200～300目硅胶装柱(硅胶与浸膏质量比为1∶50)，依次用不同体积比的石油醚-乙酸乙酯(10∶1，7∶1，5∶1，3∶1，1∶1)及乙酸乙酯进行梯度洗脱，洗脱液经硅胶薄层鉴别后，合并组成相似的流分，每个流分再经硅胶、C18反复柱层析，得到化合物a～e。

1.2.2 色谱条件 Agilent Extend-C18 柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(70:30，V∶V)；流速1 mL/min；柱温30 ℃；进样体积10 μL。

1.2.3 质谱条件 电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；质量扫描范围m/z100～1 500；雾化气和干燥气均为氮气，纯度>99.99%；干燥气流速11 L/min；雾化气压力241.5 kPa；碰撞气为氦气；喷雾电压3 500 V；碰撞能量1 eV；采用Agilent 6300离子阱工作站(6.1版)进行数据处理。

1.2.4 量子化学计算方法 所有理论计算均应用Gaussian03 程序完成，采用密度泛函(DFT)法并选择6-31G基组，几何优化分析在B3LYP/6-31d水平上计算。

2 结果与讨论

2.1 一级质谱分析

N-烷基酰胺类成分可分为N-异丁基酰胺类(IBA)，苯乙基酰胺类(2-PEA)，苯乙基酰胺类(4-OH PEA)等，它们结构相似，区别仅见于组成它们的胺结构不同。在电喷雾正离子模式下，5种化合物均以[M+H]+准分子离子形式存在，几乎没有碎片离子，易于确定化合物的相对分子质量。5种N-烷基酰胺类成分(分别对应化合物a～e)的化学结构式示于图1，其一级质谱图示于图2。

图1 5种N-烷基酰胺类化合物的化学结构式Fig.1 Chemical structures of five N-alkylamides

注：a.十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺；b.十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；c.十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；d.十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；e.十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺图2 正离子模式下，5种N-烷基酰胺化合物的ESI-MS图Fig.2 ESI-MS spectra of five N-alkylamides in positive ion mode

2.2 ESI-MSn分析

为进一步分析化合物的结构与裂解途径的关系，对5种化合物的ESI-MSn碰撞诱导裂解(CID)规律进行研究，所得的质谱图示于图3。5种化合物在正离子模式下的ESI-MSn碎片裂解信息列于表1。

2.2.1 异丁基酰胺类(IBA)化合物的质谱裂解途径分析 十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺属于IBA类，准分子离子[M+H]+为m/z224。由图3a可知，在二级质谱图中出现了两个相对丰度较高的碎片离子m/z168和m/z151。其中，m/z168是化合物结构上的N位发生α裂解丢失异丁基而形成的碎片离子；m/z151是化合物结构上的N位发生α裂解丢失N-异丁基而形成的碎片离子。在其三级质谱图中，出现了m/z133和m/z123碎片离子。其中，m/z123是由m/z151离子碎裂失去羰基(28 u)形成的碎片离子；m/z133可能是由m/z151离子经电荷转移和重排失去水(18 u)形成的碎片离子。在四级质谱图中，m/z133碎片进一步丢失C2H4(28 u)碎片，生成m/z105碎片离子。

注：a.十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺；b.十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；c.十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；d.十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺；e.十一-2E,4E-二烯-8,10二炔酸-苯乙胺图3 5种N-烷基酰胺类化合物的ESI-MSn图Fig.3 ESI-MSn spectra of five N-alkylamides

2.2.2 4-羟基苯乙基烷基酰胺类(4-OH PEA)化合物的质谱裂解途径分析 十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺、十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺3个化合物属于4-OH PEA类，它们的区别是不饱和脂肪酸链长度不同，结构上相差(C2H4)n。下面以十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺为例，对这类成分的裂解途径进行阐释。

十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的准分子离子[M+H]+为m/z288，由图3b可见，在二级质谱图中出现了两个相对丰度较高的碎片离子m/z168和m/z151。其中，m/z168是准分子离子[M+H]+化合物结构上的N位发生α裂解丢失4-羟基苯乙胺而形成的碎片离子；而m/z151是该化合物结构上的N位发生α裂解丢失N-4-羟基苯乙胺而形成的碎片离子。在三级质谱图中，出现了m/z133和m/z123碎片离子。其中，m/z123是由m/z151离子碎裂失去羰基(28 u)形成的碎片离子；m/z133离子可能是由m/z151离子经电荷转移和重排失去水(18 u)形成的碎片离子。在四级质谱图中，m/z133而进一步丢失C2H4(28 u)而生成m/z105碎片离子。

十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺和十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的裂解模式示于图4。

十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺(图3c)与十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺(图3d)因结构上有较长的直链烷基，还出现了一系列相差(CH2)n的碎片离子，如：十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的三级质谱图中，母离子m/z207丢失水及质量数相差14的一系列碎片离子生成m/z189和m/z161、147、133、119。

表1 正离子模式下，5种N-烷基酰胺类化合物的多级碎片信息Table 1 Fragmentation of five N-alkylamides in positive ion mode

图4 十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺和十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺的裂解模式Fig.4 Fragmentation patterns of deca-2E, 4E-dienoicacid isobutylamideylamide and deca-2E,4E-dienoicacid-4-hydroxyphenylethlamide

图5 十一-2E,4E-二烯-8,10-二炔酸-苯乙胺的裂解模式Fig.5 Fragmentation pattern of undeca-2E,4E-diene-8,10-diynoic acid phenylethylamide

2.2.3 苯乙基酰胺类(2-PEA)化合物的质谱裂解途径分析 十一-2E,4E-二烯-8,10-二炔酸-苯乙胺属于2-PEA类化合物，其分子离子[M+H]+为m/z278，由图3e可见，二级质谱图中，m/z157是由m/z278化合物结构上的N位发生α裂解丢失N-苯乙基而形成的碎片离子；在三级质谱图中，出现了m/z145碎片离子，它是由m/z157离子碎裂失去C(12 u)形成的碎片离子；在四级质谱图中，母离子m/z145经电荷转移和重排失去水(18 u)生成了m/z127碎片离子，其可能的裂解途径示于图5。

2.2.4 质谱裂解的量子化学计算 通过分析十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺、十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺这4种化合物的多级质谱数据，发现它们具有相似的质谱裂解规律，即在发生酰胺结构上N-位，裂解后，继续丢失H2O(18 u)，推测其脱水后可能生成的结构为二烯炔或二炔。采用量子化学计算分别对这两种结构进行最低能量构象的优化，二烯炔结构优化后最低能量HF=-388.319 2 a.u.，二炔结构优化后最低能量HF=-388.233 1 a.u.，说明二烯炔结构更加稳定，可由此确认以上4种化合物的三级质谱离子为二烯炔结构。

3 结论

采用HPLC-ESI-MSn法对阿纳其根中分离得到的5种N-烷基酰胺类成分进行质谱裂解机制研究，结合量子化学计算法，分析了这类成分的主要碎片离子和裂解模式。结果表明，在正离子模式下，5种N-烷基类成分具有相似的质谱裂解规律，均易形成[M+H]+准分子离子，然后进一步发生N-位的α裂解，丢失酰胺结构中胺的部分、羰基、水等碎片形成碎片离子。采用量子化学计算法对十-2E,4E-二烯酸-异丁基胺、十-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺、十二-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺和十四-2E,4E-二烯酸-4-羟基苯乙胺等4种化合物的三级质谱离子进行了最低能量构象的优化，结果显示，二烯炔结构更加稳定。通过对这5种N-烷基酰胺类成分质谱裂解机制的研究，可为N-烷基酰胺类成分的结构鉴定及复杂样品的快速检测提供理论依据和方法参考。

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Fragmentation Pathways and Patterns ofN-Alkylamides by ESI-MSn

DONG Jie, JI Jiao-jiao, WANG Jia-li, YUAN Jiang, GAO Jian, ZHANG Ya-li, JI Rui-fang, QUAN Qing-hua, TAN Peng, LIU Yong-gang

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

There are 4 main types ofN-alkylamides inAnacycluspyrethrumDC., namely, isobutylamide (IBA),N-Me isobutylamide (N-Me IBA), 2-phenylethylamide (2-PEA) and 4-hydroxyphenylethylamide (4-OH PEA). However, there was very few research on the fragmentation pathways ofN-alkylamides by now. In order to obtain accurate and comprehensive information about the fragmentation pathways ofN-alkylamides, 5 kinds ofN-alkylamides were analyzed by HPLC-ESI-MSn. They are identified as deca-2E, 4E-dienoicacid isobutylamideylamide, undeca-2E, 4E-diene-8, 10-diynoic acid phenylethylamide, deca-2E, 4E-dienoicacid 4-hydroxyphenylethlamide, dodeca-2E, 4E-dienoicacid 4-hydroxyphenyl-ethylamide and tetradeca-2E, 4E-dienoic acid 4-hydroxyphenylethylamide. Multi-stage mass spectrum diagrams of fiveN-alkylamides were obtained in positive ion mode. Simultaneously, the method of quantum computational chemistry was adopted to verify their fragmentation pathways. Characteristic fragment ions were identified and the patterns were deduced further. The fragmentation patterns and structural assignment of ‘isobutylamides (IBA)’type, ‘2-phenylethylamide(2-PEA)’ type and ‘4-hydroxyphenylethyl-amides (4-OH PEA)’ type in ESI-MSnunder positive ion mode were summarized. The results show that fiveN-alkylamides have the similar fragmentation pathway, [M+H]+is prone to α-cracking inN-position at the first, loss of 28(CO), 18(H2O) subsequently. These compounds have strong pyrolysis rules and the study can provide reference forN-alkylamides in structural identification and quantitative analysis.

N-alkylamides; ESI-MSn; fragmentation pathways; quantum computational chemistry

2016-06-06;

2016-10-03

新疆自然科学基金项目(201318101-5)资助

董 洁(1993—)，女(汉族)，甘肃人，硕士研究生，中药化学专业。E-mail: dongjie5255@163.com

谭 鹏(1980—)，男(汉族)，山东潍坊人，副教授，从事中药炮制研究。E-mail: tanpengtcm@163.com

刘永刚(1981—)，男(汉族)，山东临沂人，副教授，从事中药化学研究。E-mail: liuyg0228@163.com

O657.63

A

1004-2997(2017)01-0083-06

10.7538/zpxb.2017.38.01.0083