杏叶总黄酮提取工艺及抗氧化性研究

李济芳，李芳，金舒宁，柯可，王景雪，李晨

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

杏叶总黄酮提取工艺及抗氧化性研究

李济芳，李芳，金舒宁，柯可，王景雪，李晨

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

以杏叶为材料，在单因素试验的基础上，用正交试验的方法优化醇提法的提取工艺，得到最佳提取条件为：料液比1∶40（g/mL），温度60℃，提取时间6 h，乙醇体积分数30%。在此条件下，杏叶总黄酮得率达23.98%。醇提物通过旋蒸纯化，浓缩后溶入95%乙醇中得到纯化杏叶黄酮。通过杏叶黄酮对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基的清除抑制能力研究其抗氧化活性。结果表明，杏叶黄酮对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基具有较高的清除抑制能力，且杏叶黄酮对自由基的清除能力均随着其浓度增加而增加。当黄酮质量浓度为1.0 mg/mL时，对DPPH自由基清除率为44.69%；当黄酮质量浓度为0.8 mg/mL时，对羟自由基清除率为76.28%，对超氧阴离子自由基清除能力为84.75%。由此可知，杏叶黄酮具有较强的抗氧化活性。试验结果可为植物源抗衰老食品添加剂的研究提供理论依据。

杏叶；总黄酮；醇提法；正交试验；抗氧化

近年来，具有抗氧化作用的植物提取物逐渐引起了人们的广泛重视。植物提取物具有安全、高效、稳定、可控、无毒等优点，因此，植物源的天然抗氧化剂也成为人们研究开发的重点。天然抗氧化剂能有效清除自由基从而保护机体健康，从植物中寻找高效、廉价、无毒的天然抗氧化剂成为目前抗氧化剂发展的一个必然趋势。植物提取物中的黄酮类物质不仅具有抑菌活性[1]，而且还具有良好的抗氧化和消除自由基的作用，对人体具有重要的生理保健功效[2]。因杏叶具有纯天然、来源广、价格经济等优点，本试验选用杏叶作为研究材料。

杏（Armeniaca vulgaris Lam.）的果核中含有丰富的苦杏仁苷，其对人体的免疫调节、抗炎、抗肿瘤有良好的功效[3]。杏的种皮中含有较多黑色素，有良好的抗氧化功能[4]。杏果肉的黄酮提取物具有降血脂的功效，且在抗氧化试验中，对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基均有良好的清除作用[5-6]。但是对杏叶提取物却未见研究报道。

本研究从杏叶中提取总黄酮，在单因素试验的基础上做正交试验，确定了提取杏叶总黄酮的最佳提取条件后，用醇提法提取杏叶的黄酮类物质，将黄酮类物质旋蒸浓缩得到杏叶黄酮，检测纯化物黄酮含量，并进行其对DPPH自由基、羟基自由基及超氧阴离子自由基清除抑制能力的测定，评价其抗氧化活性，旨在为新的抗氧化植物源的研究开发利用以及为研发抗衰老的植物源食品添加剂提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

杏叶取材于山西大学校园内，将植物叶子阴干，粉碎机粉碎后密封避光保存；芦丁标准样品；无水乙醇；95%乙醇；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠；DPPH；Vc标准品；硫酸亚铁；Tris；邻苯三酚；水杨酸；过氧化氢；盐酸等化学试剂均为分析纯。

DK-8D型电热恒温水槽，上海精宏试验设备有限公司；UV-2000紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；Scout SE电子天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；GZX-9076MBE电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HC-2066高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；HC-150T2高速粉碎机，永康市绿可食品机械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 总黄酮含量的测定[7]

1.2.1.1 芦丁标准曲线的绘制称取10.0 mg芦丁，用95%乙醇完全溶解后定容至100 mL作为标准溶液。精密量取0，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL标准溶液分别置于10 mL具塞试管中，用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定其吸光度值。其步骤为：分别加5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min。再加10%硝酸铝溶液0.5 mL，摇匀，放置6 min。最后加4%氢氧化钠溶液4 mL，用95%乙醇定容至10 mL，摇匀，放置15 min。以相应试剂为空白，于510 nm处测定不同浓度的芦丁溶液吸光值。以芦丁浓度为横坐标、吸光度值A为纵坐标绘制芦丁标准曲线。

1.2.1.2 样品黄酮含量的测定取植物叶子粉末，根据设定的料液比、乙醇体积分数、温度、水浴时间用醇提法进行提取，将醇提物离心，吸取上清液1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，按标准曲线的操作方法测定吸光度值，以相应浓度乙醇代替上清液为空白，待测液稀释合适倍数，在510 nm处测定吸光度值，根据芦丁标准曲线计算总黄酮含量。

1.2.2 醇提法提取总黄酮的工艺优化

1.2.2.1 杏叶单因素试验参考植物源黄酮提取的相关文献[8-11]，确定出杏叶单因素试验中各因素的水平（表1）。

表1 单因素试验因素水平

根据表1的参数设置，按1.2.1.2的方法进行操作。根据总黄酮含量计算黄酮得率，确定杏叶提取的最佳条件范围。

1.2.2.2 杏叶正交试验根据1.2.2.1的试验结果得出杏叶的最佳提取条件，在最佳条件的基础上设计四因素三水平正交试验，试验设计列于表2，3次重复。

表2 正交试验因素水平

1.2.3 杏叶总黄酮提取物的浓缩及初步纯化将杏叶醇提法得到的总黄酮进行旋蒸，茄型瓶壁上固体用95%乙醇溶解。瓶中未被旋蒸干燥的物质进行减压过滤后在烘箱中干燥，干燥后的粉末用95%乙醇溶解，得到杏叶黄酮，并按1.2.1.2的操作方法在510 nm处测定吸光度值，计算得到的杏叶黄酮浓度，将制备好的杏叶黄酮放入锥形瓶中标记冷藏保存待用。

1.2.4 杏叶黄酮对DPPH自由基清除效果的测定

参考韦献雅等[12]、张京芳等[13]的文献，将DPPH自由基用95%乙醇配制成0.1 mmol/L溶液。在2 mL不同质量浓度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）杏叶黄酮样品中分别加入2 mLDPPH自由基溶液，在暗处放置30 min，于517 nm处测定吸光度值（A样品），对照以相同体积95%乙醇代替样品测定吸光度值（A对照），清除自由基能力用SC表示，吸光度值用A表示。所有的吸光度值均测定3次，结果取平均值。计算公式如下。1.2.5杏叶黄酮对羟自由基清除能力的测定将杏叶黄酮稀释成黄酮质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL的乙醇溶液，在不同质量浓度的1 mL样品溶液中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、30%过氧化氢各1 mL，静置15 min，在510 nm处测定吸光度值（Ax），对照以相同体积蒸馏水代替样品测定吸光度值（A0），本底值以相同体积蒸馏水代替30%H2O2测定吸光度值（Ax0）。清除自由基能力用SC表示[14]。计算公式如下。

1.2.6 杏叶黄酮对超氧阴离子自由基抑制能力的测定将杏叶黄酮稀释成黄酮质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL的乙醇溶液，在不同质量浓度的1 mL样品溶液中加入Tris-HCl溶液（pH值8.2）4.5mL、蒸馏水3.2mL，混匀后37℃预热20 min，取出后立即加入预热的3 mmol/L邻苯三酚0.5 mL，迅速摇匀后于波长320 nm处每隔30 s测吸光度，计算线性变化范围内吸光度增加值（ΔAx），对照以相同体积蒸馏水代替样品测定吸光度值（ΔA0），清除自由基能力用SC表示[15-16]。计算公式如下。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

按1.2.1.1方法测定不同质量浓度的芦丁吸光度（A），以吸光度值为纵坐标Y，芦丁标准品质量浓度X为横坐标，进行线性回归绘制标准曲线。

从图1可以看出，在510 nm处得到回归方程为y＝0.744 3x-0.002 9（R2＝0.999 4）。

2.2 杏叶总黄酮提取单因素试验结果

按照试验方法1.2.2.1杏叶总黄酮提取单因素预试验的设计，提取杏叶总黄酮，结果列于表3。

表3 杏叶总黄酮提取单因素各水平的总黄酮含量%

从表3可以看出，杏叶总黄酮较适宜的提取条件为：料液比1∶30（g/mL），温度80℃，时间6 h，乙醇体积分数40%。

2.3 杏叶总黄酮提取正交试验结果

醇提法提取植物黄酮类物质的影响因素较多，综合考虑了各种影响因素，经过提取时间、乙醇体积分数、温度以及料液比等单因素试验确定杏叶总黄酮提取的最佳提取条件后，采用L9（34）正交表做正交试验，结果如表4所示。

表4 L9（34）正交试验设计及总黄酮得率

对表4试验结果进行方差分析，结果如表5所示。由表5可知，重复间方差不显著，处理间方差均达到极显著。说明该试验设计合理，结果可靠，各处理因素均对杏叶总黄酮提取率有极显著影响。

根据极差分析结果（表4）可知，影响杏叶总黄酮提取率的因素依次为C＞A＞D＞B，即水浴时间＞料液比＞乙醇体积分数＞水浴温度，最佳提取工艺为A3B1C3D1，即料液比1∶40（g/mL），温度60℃，时间6 h，乙醇体积分数30%。在此工艺水平下，杏叶总黄酮平均提取率可以达到23.98%。

表5 正交试验结果方差分析

2.4 杏叶黄酮对DPPH自由基的清除效果

得到杏叶总黄酮溶液后，按照试验方法1.2.3对杏叶总黄酮进行了浓缩和初步纯化得到杏叶黄酮。按照1.2.4试验方法测定杏叶黄酮对DPPH自由基的清除效果。由图2可知，杏叶黄酮对DPPH自由基清除能力随黄酮质量浓度增加而增加，在0.2～1.0 mg/mL范围内，清除率由3.74%上升至44.69%。以Vc为参照，在黄酮质量浓度为1.0 mg/mL时，计算得到杏叶黄酮对DPPH自由基清除能力为Vc的47.69%，由此可知，杏叶黄酮具有较强的DPPH自由基清除能力。

2.5 杏叶黄酮对羟基自由基的清除效果

根据1.2.5试验方法测定杏叶黄酮对羟基自由基的清除效果，结果如图3所示。

由图3可知，杏叶黄酮的羟基自由基清除能力随黄酮质量浓度增加而增加，在0.1～0.8 mg/mL范围内，清除率由38.62%上升至76.28%。以Vc为参照，在黄酮质量浓度为0.8 mg/mL时，计算得出杏叶黄酮的羟基自由基清除能力为Vc的76.28%，可知杏叶黄酮具有强的羟基自由基清除能力。

2.6 杏叶黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果

根据1.2.6试验方法测定杏叶黄酮对超氧阴离子自由基的清除效果。从图4可以看出，杏叶黄酮对超氧阴离子自由基清除能力随黄酮质量浓度的增加而增加，在0.1～0.8 mg/mL范围内，清除率由27.12%上升至84.75%。以芦丁为参照，在黄酮质量浓度为0.8 mg/mL时，计算得出杏叶黄酮对超氧阴离子自由基清除能力为芦丁的142.86%，可知杏叶黄酮具有很强的超氧阴离子自由基清除能力。

3 讨论

本试验以杏叶为提取原料，采用醇提法提取杏叶的总黄酮，确定了提取工艺的最佳条件，即料液比1∶40（g/mL），温度60℃，提取时间6 h，乙醇体积分数30%；利用旋转蒸发的方法对粗提物进行了浓缩和初步纯化。并对杏叶黄酮进行了体外抗氧化活性测定，证明杏叶黄酮具有较强的DPPH自由基清除能力、强的羟基自由基清除能力和很强的超氧阴离子自由基抑制能力，且杏叶黄酮对自由基的清除能力均随浓度增加而增加。在0.2～1.0 mg/mL范围内，杏叶黄酮对DPPH自由基清除率由3.74%上升至44.69%，对DPPH自由基清除能力的最高为Vc的47.69%；杏叶黄酮质量浓度在0.1～0.8 mg/mL范围内，对羟基自由基清除能力由38.62%上升至76.28%，对羟基自由基清除能力的最高为Vc的76.28%；对超氧阴离子自由基清除能力由27.12%上升至84.75%，且对超氧阴离子自由基清除能力的最高为芦丁的142.86%。由此可确定，杏叶提取物中含有较为丰富的黄酮类物质，并且其具有较强的体外抗氧化活性。

杏叶目前在农业生产中是作为废料被丢弃的，每年有大量的杏叶遗留在田间，若能加以利用，无疑将会为农民带来一定的额外收益。本试验结果显示，杏叶经过简单的提取加工将会得到抗氧化效果较好的杏叶黄酮，杏叶黄酮可以进一步制作成食品添加剂及保健品。这一研究结果，为杏叶制品的进一步研发提供了理论依据，同时也能够把杏叶变废为宝，符合国家低碳环保建设的要求，不仅具有学术研究意义，而且也具有生产实践意义。

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Study on Extraction Process and Antioxidative Activity of Total Flavonoids from Apricot（Armeniaca vulgarisLam）Leaves

LI Jifang，LI Fang，JINShuning，KE Ke，WANGJingxue，LI Chen
（College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Based on the single factor experiments,the orthogonal texts were employed to optimize the extraction conditions of flavonoids from Armeniaca vulgaris Lam leaves.The results of optimal extraction conditions were material-liquid ratio of 1∶40（g/mL）, extraction temperature of60℃,extraction time of6 hours and ethanol concentration of30%.Under the optimal conditions,the maximum extraction rate oftotal flavonoids was 23.98%.The alcohol extracts were purified byrotaryevaporation and re-dissolution in 95%ethanol. The results of antioxidation experiments showed that the purified total flavonoids of apricot leaves had strong scavenging capacity on DPPH·,·OH and O2-which increased in a dose-dependent manner.When the total flavonoid concentration was 1.0 mg/mL,the scavenging capacity against DPPH·was 44.69%.When the total flavonoid concentration was 0.8 mg/mL,the scavenging capacity against·OH and O2-was 76.28%,84.75%,respectively.Accordingly,the purified total flavonoids ofapricot leaves had strong antioxidant activity.And the results can provide a theoretical basis for the studyofplant-derived anti-agingfood additives.

apricot leaves;total flavonoids;ethanol extraction;orthogonal test;antioxidant activity

TQ914.1

A文献标识码：1002-2481（2017）02-0258-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.02.29

2016-10-11

山西大学第十三期本科生科研训练项目

李济芳（1995-），女，山西大同人，在读本科，研究方向：植物生物技术。王景雪为通信作者。